化瘀消癥杀胚中药诱导输卵管妊娠滋养细胞凋亡的分子机制及临床研究

作者:李晓荣|邓高丕
2015-4-30 阅读

摘    要

  异位妊娠(Ectopic pregnancy,EP)指受精卵在子宫腔以外的部位着床发育,其中超过95%患者为输卵管妊娠 [1]。输卵管妊娠是最常见的妇产科急腹症,占妇科急症的80%以上,首诊延误率可高达40%,是孕早期死亡的主要原因之一。近些年来,随着盆腔炎性疾病、人工流产、辅助生殖技术等高危因素的增加,输卵管妊娠的发病率呈逐年上升趋势,严重威胁育龄妇女的生命健康和生活质量。随着诊疗技术的发展使早期异位妊娠得以发现,使药物治疗成为可能,为更多年轻的患者提供了保全生育功能的机会。
  中医公认异位妊娠的发病机理是少腹血瘀证[2],采用活血化瘀、消癥杀胚方药治疗早期输卵管妊娠疗效确切。化瘀消癥杀胚中药复方是根据中医理论而制定,由丹参、赤芍、桃仁、天花粉、紫草五味药组成,是宫外孕Ⅰ号方衍化而来,临床疗效确切[3],最大限度保全了患者的生育功能,提高了生活质量。

一、临床部分

目的:

  结合前期输卵管妊娠的中西医结合诊疗方案的研究,采用前瞻性、无盲法、不等随机对照研究,从临床有效性方面论述中药+MTX与中药+米非司酮治疗输卵管妊娠的疗效及优势,为临床选择用药提供依据。

研究方法:
  选择2012年1月至2013年12月输卵管妊娠病例,进行辨病分期,计算病情影响因子总积分后,确定可以进行“中西医结合”药物治疗的病例,随机将病例分为中药+MTX组与中药+米非司酮组。通过对比两组间的有效率、有效病例的腹痛消失时间、血β-HCG值下降时间、包块缩小情况,探讨中药+MTX与中药+米非司酮治疗输卵管妊娠各自的优势及可行性。

研究结果:
(一)纳入病例情况:根据诊断标准、纳入标准及排除标准,2012年1月至2013年12月共收集符合中西医结合药物治疗的输卵管妊娠病例103例,中药+MTX组54例,中药+米非司酮组49例。
(二)病情影响因子情况
  103例病例中,25-29岁年龄段所占比例最高,约占38.8%,且无生产史者占43.00%;停经天数为43-56天所占比例最高,占64.28%;腹痛症状表现为隐痛者所占比例最多,占53%;B超下包块最大径3-5cm者较多;初始血β-HCG值在1000-2000IU/L之间者所占比例最高;病情影响因子总积分,中药+MTX组为8.648±1.456分,中药+米非司酮组为8.833±1.209分。
使用t检验与秩和检验,中药+MTX组和中药+米非司酮组在年龄、孕产次、停经时间、腹痛情况、B超下包块最大径、B超下出血最大径、初始血β-HCG值和病情影响因子比较,差异无统计学意义(P>0.05)。
(三)疗效研究结果:中药+MTX组有效率为88.89%;中药+米非司酮组有效率为89.80%,两  组疗效无明显差异(P>0.05);中药+MTX组腹痛消失时间为4.23±2.52天,中药+米非司酮组为4.40±1.45天,两组比较差异无统计学意义(P>0.05);观察组血β-HCG值下降至50%的时间中药+MTX组为5.704±1.550天,中药+米非司酮组为7.021±1.670天,两组比较中药+MTX组较中药+米非司酮组降HCG值效果更好(P<0.05);下降至10%的时间中药+MTX组为20.34±6.22天,中药+米非司酮组为21.47±8.92天,两组总的降HCG水平方面效果相当(P>0.05);中药+MTX组包块缩小率为85.19%,中药+米非司酮为73.47%,中药+MTX组在包块缩小程度方面优于中药+米非司酮组(P<0.05)。

 

二、实验部分

目的:
  探讨化瘀消癥杀胚中药复方对输卵管妊娠滋养细胞凋亡的形态学、凋亡率及细胞凋亡通路影响,比较输卵管妊娠滋养细胞和宫内早期妊娠滋养细胞外观形态、生长曲线及化瘀消癥杀胚中药复方作用后凋亡率、凋亡形态及凋亡通路的异同。
方法:
(一)输卵管妊娠滋养细胞及宫内早孕滋养细胞的培养,免疫荧光细胞化学染色法进行细胞鉴定,绘制细胞生长曲线。
(二)运用CCK-8法检测化瘀消癥杀胚中药复方对两种滋养细胞生长抑制的影响,Hoechst染色、透射电镜观察化瘀消癥杀胚中药复方对两种细胞凋亡形态学及超微结构的影响,流式细胞仪Annexin V-FITC/PI法检测化瘀消癥杀胚中药复方干预后两种滋养细胞的凋亡率。
(三)Western Blot及qRT-PCR法检测化瘀消癥杀胚中药复方对两种滋养细胞Bax、Fasl、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白及基因的影响。

研究结果:
(一)成功培养了输卵管妊娠滋养细胞及正常宫内早孕滋养细胞,免疫荧光细胞化学染色法鉴定结果显示细胞胞浆中有CK-18 、cerb-2阳性信号,未见波形蛋白信号。两种细胞生长周期大致相同,均在第3-4天时达对数生长周期,5-6天后因细胞生长密度抑制作用进入平台期。
(二)CCK-8法检测发现,经过终浓度为5、10、20、30、40mg/ml的化瘀消癥杀胚中药处理后的两种滋养细胞,不同作用时间对其的生长抑制作用各不同,其量效关系呈时间、浓度正相关性。化瘀消癥杀胚中药复方对输卵管妊娠滋养细胞作用48h的半数最大抑制浓度:IC50=20.12mg/ml;对宫内妊娠滋养细胞作用48h的半数最大抑制浓度:IC50=23.98mg/ml。以此为依据,确定后续实验中药浓度,分别为中药高剂量组20mg/ml、中剂量组10mg/ml、低剂量组5mg/ml。
(三)Hoechest染色法在倒置荧光显微镜下观察可见,不同浓度中药复方组中均出现不同程度核固缩、核碎裂及凋亡小体,以中药高剂量组20 mg/ml及中药+甲氨蝶呤组最明显。透射电镜下观察发现化瘀消癥杀胚中药复方作用48h后,滋养细胞表面微绒毛减少,体积变小、不同程度皱缩,常染色质变少,异染色质增多,集中在核仁边缘,或核仁萎缩、破裂,个别形成凋亡小体,内质网扩张呈泡状,与质膜融合,细胞器外渗、肿胀、细胞质内空泡状脂滴显著增多。两种滋养细胞的凋亡形态及超微结构无明显差异。
(四)流式细胞仪Annexin V-FITC/PI法检测各药物组作用于输卵管妊娠滋养细胞48h后,与阴性对照组相比,随着药物浓度的增加,细胞凋亡率也相应增加,其中高、中剂量组凋亡率明显增加(P<0.01);与甲氨蝶呤组相比,中药高剂量组凋亡率增加(P<0.05),而中药+甲氨蝶呤组与中药高剂量组凋亡率无明显差异。各药物组作用于宫内滋养细胞48h后,与阴性对照组相比,随着药物浓度的增加,细胞凋亡率也相应增加,其中高剂量组凋亡率明显增加(P<0.01);中药高、中剂量组与甲氨蝶呤组及中药+甲氨蝶呤组相比,凋亡率无明显差异(P>0.05)。各个药物组作用两种细胞48h后细胞凋亡率相比,并无明显差异(P>0.05)。
(五)输卵管妊娠滋养细胞中,与阴性对照组相比,中药组及中药+甲氨蝶呤组可使Bax、Fasl、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达增加,且中药高剂量组、中药+甲氨蝶呤组还可增加Fasl、Caspase-3的基因表达(P<0.05),而Caspase-8蛋白增加不明显(P>0.05),但基因表达明显增加;甲氨蝶呤组仅Caspase-9蛋白表达增加。在宫内妊娠滋养细胞中,与阴性对照组相比,中药组及中药+甲氨蝶呤组可使Bax、Fasl、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白表达增加(P<0.05),且中药高剂量组还可增加Bax、Fasl、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9基因的表达(P<0.05);甲氨蝶呤组Fasl、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白表达增加(P<0.05),Fasl的基因表达亦增加(P<0.05)。

结论
(一)中西医结合治疗输卵管妊娠疗效确切,中药+MTX在缩小包块方面疗效优于中药+米非司酮组,在HCG值下降、阴道流血、腹痛消失等方面疗效相当。
(二)输卵管妊娠和宫内妊娠滋养细胞在形态和增殖能力上并无显著的差异,其生长特性相似。
(三)化瘀消癥杀胚中药复方有抑制输卵管妊娠滋养细胞增殖、促进其凋亡的作用,这可能是其降低HCG、缩小异位妊娠包块治疗异位妊娠的机制之一。化瘀消癥杀胚中药对宫内妊娠滋养细胞的促凋亡作用和凋亡形态学方面与输卵管妊娠滋养细胞无明显差异。
(四)化瘀消癥杀胚中药复方作用输卵管妊娠滋养细胞及宫内妊娠滋养细胞后,均可上调Fas/FasL、Bcl-2/Bax凋亡通路相关蛋白的表达,提示化瘀消癥杀胚中药复方可能通过诱导Caspase介导的死亡受体及线粒体凋亡通路而促进滋养细胞凋亡。
关键词:  化瘀消癥杀胚中药;输卵管妊娠;中西医结合治疗方案;细胞凋亡

 

引    言

  异位妊娠(Ectopic pregnancy,EP)指受精卵在子宫腔以外的部位着床发育,其中超过95%患者为输卵管妊娠[1]。输卵管妊娠是最常见的妇产科急腹症,占妇科急症的80%以上,首诊延误率可高达40%,是孕早期死亡的主要原因之一。近些年来,随着盆腔炎性疾病、人工流产、辅助生殖技术等高危因素的增加,输卵管妊娠的发病率呈逐年上升的趋势,严重威胁育龄妇女的生命健康和生活质量。随着诊疗技术的发展使早期异位妊娠得以发现,使药物治疗成为可能,为更多年轻的患者提供了保全生育功能的机会。
  中医公认异位妊娠的发病机理是少腹血瘀证[2],采用活血化瘀、消癥杀胚方药治疗早期输卵管妊娠疗效确切。早在1958年山西医学院第一附属医院首先使用宫外孕Ⅰ号、Ⅱ号方保守治疗异位妊娠,取得突破性进展后,中药治疗异位妊娠在临床上得到广泛应用。化瘀消癥杀胚中药复方是根据中医理论而制定,由丹参、赤芍、桃仁、天花粉、紫草五味药组成,是宫外孕Ⅰ号方衍化而来,临床上应用化瘀消癥杀胚中药复方治疗早期输卵管妊娠成功率达88.9%[3],最大限度保全了患者的生育功能,提高了生活质量。中药治疗异位妊娠的作用已得到多数医家的证实,而中西医结合(中药+甲氨蝶呤或米非司酮)治疗异位妊娠作用优于单纯西药治疗亦被较多医家认可并应用于临床,但中药+MTX和中药+米非司酮是否各自有其优势,临床未见大量报道。本课题临床部分在此基础上,对比了中药+MTX和中药+米非司酮治疗异位妊娠的疗效和各自优势,为临床选择用药提供依据。
  导师课题组经过多年的临床及实验研究,认为化瘀消癥杀胚中药复方可能通过影响滋养细胞侵袭微环境来干预滋养细胞向周围组织的侵袭治疗早期异位妊娠。在此研究基础上本实验进一步研究化瘀消癥杀胚中药对输卵管妊娠滋养细胞可能的促凋亡细胞通路,并同时设立了宫内妊娠滋养细胞组,对比了两种细胞在生长特性,凋亡形态学及诱导凋亡细胞通路方面的异同,丰富了化瘀消癥杀胚中药的作用机理,为进一步寻找治疗靶点提供了理论依据。

第一章  文献研究

第一节 异位妊娠的流行病学研究
  早在11世纪一位阿拉伯医生从患者脐部化脓性窦道中拉出了胎儿骨骼,继而提出了异位妊娠(ectopic pregnancy,EP)的概念[4],意指受精卵在子宫腔以外的部位着床发育,超过95%患者为输卵管妊娠[1]。EP是最常见的妇产科急腹症,占妇产科急症的80%以上,首诊延误率可高达40%,是孕早期死亡的主要原因之一。近些年来,异位妊娠的发病率呈逐年上升的趋势,严重威胁育龄妇女的生命健康。

一、发生率和死亡率
  在发达国家,异位妊娠的发生率在正常妊娠中占1%-2%[5]。1970年-1990年间是异位妊娠发生率增长高峰期,据北美统计1970年异位妊娠为17800例,至1990年增长至108800例,短短20年间增长近6倍[6],而此后呈稳步增长。导致发生率迅速增长的原因大致有三:感染性疾病及吸烟女性比例的增加,辅助生殖技术的大力开展,早期妊娠辅助检查技术的提高[7]。在英国,平均每年有10000个异位妊娠患者,其发生率(11.1/1000正常妊娠)与挪威(14.9/1000)澳大利亚(16.2/1000)相似[8-9]。法国一项研究发现,1992-2002年间,因生殖失败导致EP的占17%,而因避孕失败导致EP的占29%[10]。
  在美国,异位妊娠仍然是导致早期妊娠妇女死亡的主要原因(0.35/1000 EP)[11],非裔美国人的死亡率是白种人的6.8倍,35岁以上35岁以下的3.5倍。EP死亡率是早期人工流产患者的50倍,顺产患者的10倍[11]。而随着诊疗技术的提高,孕产妇中异位妊娠的死亡率在怀孕人群中由1970年3.5/10000降至1992年2.9/10000[13],在孕产妇死亡总数中由1987年12%降至2011年9%。亦有报道称英国自1994年后,异位妊娠总的死亡率(0.35/1000 EP in 2003–2005)呈平台期[5]。EP最常见的死亡原因是出血、感染、麻醉并发症,这也是所有妊娠导致死亡最常见的原因。EP死亡患者中约5%诊断明确但未及时治疗,出血死亡的患者中70%未及时行手术治疗,这些数据提示我们异位妊娠潜在的致命性危险。
  超过95%的异位妊娠发生在输卵管部,而壶腹部是受精卵着床最常见的部位,约占总EP的78.6%,峡部(12.3%)、伞端(6.1 %)、间质部(1.5 %)[1].
二、相关高危因素
  尽管异位妊娠没有直接相关的危险因素,但是在一个前瞻性病例对照研究中发现增加异位妊娠相关风险因素的知识及危机意识,有助于早期准确诊断异位妊娠[14]。
(一)输卵管损伤相关
  大多数异位妊娠危险因素均与输卵管损伤相关,一切可导致输卵管功能和形态变化的因素均可能为异位妊娠的危险因素。
1. 盆腔炎性疾病(PID)
  PID是育龄期妇女常见病和多发病,亦是异位妊娠最重要的高危因素之一,有资料报道约有1/3的异位妊娠直接或间接与PID有关,且感染次数和异位妊娠发生率呈正相关性[15]。PID的高发病率可能因分娩、流产、各种宫腔操作、性生活频繁一定程度上破坏了生殖道固有防御系统功能,造成机体局部抵抗力下降,或宫腔操作无菌意识不强、性生活不洁等致阴道正常菌群或外源性微生物上行入侵,而形成盆腔炎症,包括子宫内膜炎、输卵管炎、盆腔脓肿等。目前研究与异位妊娠相关的有沙眼衣原体(CT)、淋病奈瑟菌、解脲支原体(UU)等。Akande等研究发现异位妊娠患者中约30-50%与CT有关[16]。因70%-90%的CT、UU感染无明显临床症状,患病女性未及时接受治疗导致这部分患病人群中EP发生率增高[17]。于红侠等[18]发现,输卵管妊娠与CT及UU感染关系密切,CT感染是输卵管妊娠的重要原因之一,认为通过PCR方法对宫颈CT、UU感染者进行筛查并及早治疗,有望减少盆腔粘连,降低异位妊娠的发生率。盆腔炎症可使输卵管粘连、扭曲、管壁肌肉蠕动减弱,从而影响孕卵正常运行,其中输卵管炎是异位妊娠常见病因,严重者可引起管腔完全堵塞,轻者因输卵管粘膜皱壁粘连导致管腔狭窄,或是纤毛缺损,阻碍孕卵在输卵管中正常运行,从而导致不孕或异位妊娠。亦有报道称PID不仅可改变输卵管形态,还可以影响输卵管内的微环境,增加EP的风险[19]。
2. 盆腔手术史
  盆腔手术尤其是直接涉及到输卵管的手术,是异位妊娠重要的危险因素之一,例如输卵管妊娠剖开取胚术、输卵管整形术、卵巢囊肿切除术等[20],原因是手术本身可造成输卵管瘢痕、狭窄或输卵管周围粘连。既往异位妊娠史的患者,不同治疗方法对其再次发生异位妊娠的影响亦不相同,如MTX、输卵管切除、输卵管剖管取胚术其复发率分别是8%、9.8%和15.4%,由此可见涉及输卵管的手术对输卵管功能影响较大。剖宫产与异位妊娠的关系一直存在争议,Mollison等认为有剖宫产术史与自然分娩者比,妊娠率下降,异位妊娠率升高[21],认为选择性剖宫产与异位妊娠可能相关。亦有学者认为不仅剖宫产与异位妊娠有关,多次自然分娩史也是异位妊娠的高危因素[22]。近些年来对异位妊娠与阑尾手术的关系研究颇多,但结果存在争议。多数研究认为阑尾穿孔是异位妊娠的高危因素,但亦有学者认为阑尾切除术并不增加异位妊娠的发生率[23]。
(二)不孕相关
  不孕史的患者也是异位妊娠发病的高危人群[24],Bouyer等在一项大样本病例对照研究中发现随着不孕时间延长发生异位妊娠的危险亦增加,即不孕症本身是异位妊娠的危险因素[16]。
1. 辅助生殖技术(ART)
自1978年首例体外受精-胚胎移植(IVF-ET)技术受孕成功,近些年来,随着不孕率的升高,辅助生殖技术发展迅速。而异位妊娠是ART的风险之一,ART临床妊娠中EP的发生率为2.1%-8.6%,输卵管性不孕组则高达11%[25]。ART后发生异位妊娠的原因尚不明确,可能与生殖道健康状态、体内激素环境、IVF-ET操作技术及胚胎移植数量、胚胎着床潜能等有关[26]。
2. 子宫内膜异位症
子宫内膜异位症多发生于生育年龄,是不孕症的高危因素之一,其对妊娠的影响除改变盆腔结构外,近些年来较多关注其对盆腔微环境的影响。Rachel等将人输卵管上皮培养于轻度子宫内膜异位症腹腔液中,发现输卵管上皮的纤毛摆动频率明显下降[27]。Mwanza等发现子宫内膜异位症腹腔液中前列腺F2α水平明显高于正常女性,前列腺F2α可以通过促进输卵管平滑肌收缩,增加输卵管峡部压力阻碍卵子及胚胎的运输,从而增加了异位妊娠的风险[28]。
(三)避孕相关
  计划生育是我国的基本国策,计划生育措施包括宫内节育器(IUD)、输卵管结扎术、口服避孕药物的使用等。当避孕失败,不同避孕方法及补救措施对异位妊娠发生有不同的影响。
1. 宫内节育器(IUD)
  IUD是否引起异位妊娠,历来是争议的焦点。早在20世纪50年代,国外学者发现异位妊娠的增加与妇女使用IUD数量上升趋势一致,认为异位妊娠的发生与IUD有关。IUD可能引起宫腔无菌炎症,改变宫腔内环境,阻碍受精卵在宫腔着床,但它不抑制排卵,卵子仍然可以在输卵管和卵巢部位受精,因此其避免绝大部分宫内妊娠,但不能防止异位妊娠。童传良等调查研究发现放置 IUD 的育龄妇女,特别是有剖宫产史者其异位妊娠的风险增加,建议放置 IUD 对象在排卵期性生活时要加用避孕套,

2. 口服避孕药(OC)
  任何避孕措施,其避孕失败时异位妊娠发生率明显高于未采取避孕措施者[30]。输卵管平滑肌的活动和粘膜细胞纤毛的活动都依赖于雌孕激素的刺激,而无论是哪种类型的避孕药,都会影响体内雌孕激素水平,从而影响输卵管功能,一旦避孕失败,则6%-10%的妊娠者为异位妊娠[31]。
3. 流产史
  人工流产和药物流产是避孕失败后常用的补救措施,文献报道,人工流产与异位妊娠密切相关,且是无流产史患者发病率的近13倍[12、32],多数人认为,流产史是异位妊娠的独立危险因素,无论是药物流产还是人工流产,均有造成炎症感染的可能,并同时损伤子宫内膜,改变了子宫内的微环境,增加了EP发生的风险。此外,亦有学者提出自然流产,特别是复发性自然流产史的患者是异位妊娠的高危因素[15]。
(四)吸烟
  吸烟是可独立发挥作用的异位妊娠危险因素,且存在剂量-效应关系,当每天吸烟数量超过20支,其异位妊娠发生率是正常人群的3.9倍[15]。据报道,吸烟者异位妊娠发生率是不吸烟人群的1.6-3.5倍。其致病机制尚不明确,可能与尼古丁导致排卵、输卵管活动节律、子宫能动性及盆腔微环境、免疫学的改变有关[31]。
(五)年龄
  随着年龄的增长,异位妊娠风险亦随之上升,35岁是一个风水岭[33]。2010年一项研究统计发现EP在15-44岁间每年平均发生率为0.64%,而在35-44岁间每年平均发生率增加至0.99%[12]。可能的机制包括随着年龄的增长,滋养层细胞染色体异常率上升及功能性卵子转运能力下降,机体暴露危险因素的可能性上升等有关[15]。
(六)其他
  有文献报道输卵管发育不良、输卵管结核、黄体功能不全、宫内乙烯雌酚暴露等亦与EP的发生有关[15]。 此外,子宫肌瘤、盆腔包块等可能压迫输卵管,使其变形、扭曲,使受精卵运输障碍导致EP的发生率增高。
  Marion LL等[12]将有明确依据的各危险因素,根据其在EP中所占比例,将EP的相关危险因素又划分为高、中、低三类,见表1。

GIFT indicates gamete intrafallopian transfer;IUD, intrauterine contraceptive device; PID, pelvic inflammatory disease; SIN, salpingitis isthmica nodosa.   

  异位妊娠严重威胁孕产妇生命健康及影响育龄女性生活质量,我们在大力发展异位妊娠诊断和治疗的同时,亦应该重视如何减低其发生率。异位妊娠往往是一种或多种高危因素同时作用的结果,因此,尽量减少一些高危因素的发生,如及时控制PID,定期衣原体、支原体的检查,做好避孕措施、减少人流次数,建立良好生活习惯、洁身自好等,以期能减少异位妊娠的发生率。
  妊娠是妇产科常见的急腹症,其中输卵管妊娠最为常见,约占98%,是孕产妇妊娠早期的主要死亡原因之一[3]。经过多年研究,一些异位妊娠的危险因素已经确定,其中包括:盆腔炎症感染、吸烟、子宫内膜异位症、既往手术史、体外受精[6、7]近年来,研究者们已在组织学、细胞形态学乃至分子生物学等各个层次对异位妊娠做了大量研究。诊断技术的发展、对疾病重视程度的提高,使得异位妊娠的早期诊断率大大提高,降低了孕妇的病死率,也为早期的非手术治疗提供了有利条件,为要求生育的患者提供了更多受孕的可能。

第二节  异位妊娠的中西医治疗进展
一、异位妊娠的中医治疗进展
  中医古籍中并无异位妊娠病名的记载,按其临床表现,可散见于“妊娠腹痛”、“停经腹痛”、 “经漏”、“妊娠下血”、“少腹瘀血”、“癥瘕”等病名中,现代中医的在《中国医学百科全书·中医妇科学》,通用“异位妊娠”或“宫外孕”之病名,其病因病机多为少腹血瘀证[2]。
  早在1958年山西医学院第一附属医院首先使用宫外孕Ⅰ号、Ⅱ号方保守治疗异位妊娠,取得突破性进展。后期医家多在此基础上临症加减,其疗效确切。郭丽春将本病分为早、中、晚三期,初期以活血杀胚为主,重用天花粉,加用蜈蚣,并配合西药甲氨蝶呤;中期以祛瘀利湿为主,多用益母草、白花蛇舌草及泽泻等;后期以消瘀通络为主,多用川芎、红花、穿山甲等,治疗率达85%[33]。刘佳[34]等以自拟宫外孕汤(丹参、赤芍各15g、桃仁、水蛭各10g、三棱、莪术各6g,天花粉、紫草根各30g, 蜈蚣3条, 皂角刺20g)配合紫草油纱外敷下腹部,总有效率达 67.11%,未见明显不良反应。黄少妮[35]等对35例早期未破裂型异位妊娠运用宫外孕Ⅱ号方临症加减三步骤保守治疗,痊愈9例,有效23 例,无效3 例,总有效率为91.43%。李道成[36]等观察腹腔镜下保守手术后应用宫外孕Ⅱ号方加味预防持续性异位妊振(PEP)的临床疗效,研究分为手术+术中向患侧输卵管系膜内注射甲氨蝶呤(MTX)组;手术+术后宫外孕Ⅱ方加味治疗组;单纯手术组,结果三组PEP发生率分别为1.9%、2.0%、12.2%,前两组的发生率明显低于C组(P<0.05),且其手术后72小时的血清β- HCG下降幅度和术后β- HCG恢复到正常的时间均明显比后一组短(P<0.05)。方开英[37]运用米非司酮配伍宫外孕Ⅰ号方及宫外孕Ⅱ号方加味治疗异位妊娠60例,治愈率85%,疗程2-4 周。余传虎[38]等用杀胚散结汤(丹参、赤芍、桃仁、紫草各15g、天花粉30g, 蜈蚣3条,田七10g)联合米非司酮、甲氨蝶呤治疗较单纯用米非司酮和甲氨蝶呤临床疗效更好。
二、异位妊娠的西医保守治疗
  西医治疗异位妊娠分为手术治疗和药物治疗,其中常用的药物治疗有甲氨蝶呤(MTX)、米非司酮(RU486),此外还有5-氟脲嘧啶(5-Fu)、氯化钾、高渗葡萄糖等。
(一)甲氨蝶呤(MTX)
  MTX是一种对滋养细胞高度敏感的化学性抗代谢药物,其通过抑制双氢叶酸还原酶而使二氢叶酸不能还原成有生理活性的四氢叶酸,导致嘌呤和嘧啶的合成被抑制,干扰DNA的生物合成,从而起到抑制滋养细胞的增生,破坏绒毛,使胚胎组织坏死、脱落并逐渐被吸收[39]。国外学者认为在保守治疗的范围内,甲氨蝶呤是一种非常安全有效的药物,一项meta分析显示单剂量(50mg/m2)治疗方法其有效率为88%,95%置信区间为86-90%,而小剂量多次注射(治疗第1、3、5、7天每次0.1 mg/kg)的有效率为93%,95%置信区间为89-96%[40]。在仔细筛选适应病例的基础上用甲氨蝶呤治疗异位妊娠其成功率在85%-95%间[41-42],而其2年后的生育率为66.9%[43]。
(二)米非司酮(mifepristone,RU486)
  RU486是一种19-去甲睾酮的衍生物,能与孕酮受体及糖皮质激素受体结合,从而产生较强的抗孕酮作用,使妊娠的绒毛组织及蜕膜组织变性,内源性的前列腺素释放,促使黄体生成素(LH)下降,黄体溶解,从而使依赖黄体发育的胚囊坏死产生流产。1985年Bygdeman和Swahn首次证明米非司酮配伍小剂量的前列腺素制剂可终止早期妊娠(宫内妊娠孕<49天),其有效率达90%以上,从而作为一种抗早孕药物在临床上推广应用,而我国是临床应用米非司酮最多的国家[44-45]。国内多数学者认为ru486有抗着床、抗排卵与诱导子宫内膜出血的作用,在受体水平上减少蜕膜中孕激素受体,促进内源性前列腺素释放,导致黄体萎缩,蜕膜变性坏死,从而达到终止妊娠的目的[46]。
  目前国内学者临床上多倾向于米非司酮与MTX联合用药。从蓉俊[47]用甲氨蝶呤联合米非司酮治疗异位妊娠36例,治愈率为80.6%。屈莉红[48]等对29例输卵管妊娠给予米非司酮联合甲氨蝶呤治疗,治愈率达93.1%。田继香[49-50]等用米非司酮联合甲氨蝶呤治疗40例异位妊娠患者,其中治愈37例,3月后行输卵管通液检查均提示输卵管完全通畅,认为二者联用能大大提高妇女的生育率。
三、课题组对异位妊娠的研究进展
  导师邓高丕教授长期从事临床研究,临床经验丰富。其研究团队以中医基础理论为指导思想,总结前人治疗思路,并根据多年的临床经验,创新并确立了输卵管妊娠中医辨证分型论治方案,归纳总结出5个输卵管妊娠的主要病情影响因子,初步建立了输卵管妊娠的病情评分模型,四诊合参,将早期输卵管妊娠归纳为未破损期的胎瘀阻滞、胎元阻络型与已破损期的正虚血瘀、气血亏脱和瘀结成癥五个中医证型,并依据此中医辨证分型方案和病情评分模型确立了输卵管妊娠的中西医结合治疗方案。化瘀消癥杀胚中药复方是邓高丕教授从治疗方案中筛选的经验方,由丹参、赤芍、桃仁、天花粉、紫草五味药组成,功效为活血化瘀、消癥杀胚。方中丹参、赤芍、桃仁活血化瘀,共为君药,天花粉清热排脓消痈杀胚,紫草破血通络,杀胚消癥,二味辅佐君药以加强化瘀消癥杀胚之力,药味精简,药效明确。
  宋阳在邓高丕教授指导下采用前瞻性研究设计方案,对718例输卵管妊娠患者进行前瞻性的辨病分期、辨证分型、计算病情影响因子总积分,然后分组治疗,观察了各组及各证型的治疗效果,结果提示临床应用输卵管妊娠辨病分期辨证论治规律及论治方案治疗本病,可较准确的判断患者的病情,及时采取合理的治疗措施,其有效率达到88.9%以上[3]。曾根在宋阳建立的早期不明位置妊娠判别方程的基础上,收集327例异位妊娠病例,代入早期不明位置妊娠判别方程应用软件中运算,综合评估该方程的临床应用价值,最终证明早期不明位置妊娠判别方程在早期不明位置妊娠判別诊断中对于早期输卵管妊娠具有较高的检出率,对位置不明妊娠的诊断有较高的准确度及预测值,证明该方程是一种具有较好的真实性、可靠性,相对理想的快速、非侵入性的判别方法,值得临床推广 [51]。
  在前期临床疗效确切的基础上,我们对化瘀消癥杀胚中药复方作用机理进行进一步的机制研究。孙佳琦[52]前期研究发现化瘀消癥杀胚中药可降低输卵管妊娠绒毛组织Bcl-2表达水平、升高妊娠输卵管粘膜ER表达水平,并对输卵管妊娠粘膜细胞超微结构(微绒毛、线粒体、细胞核、内质网)均有明显影响,通过促凋亡、影响营养供给等途径促进胚胎死亡。袁烁[53]运用体外人输卵管妊娠滋养细胞模型为研究载体,运用流式细胞法、蛋白印迹法等方法证实化瘀消癥杀胚中药复方能明显提高输卵管妊娠滋养细胞的凋亡率,并下调Bcl-2蛋白水平达到促凋亡的作用,提示化瘀消癥杀胚中药复方诱导输卵管妊娠滋养细胞凋亡的发生是其发挥杀胚效应的机制之一。王瑞雪[54]在此基础上体外实验研究发现化瘀消癥杀胚中药复方可降低输卵管妊娠滋养细胞的侵袭能力、显著降低输卵管妊娠滋养细胞ER、PRm-RNA的表达、可显著增加输卵管妊娠滋养细胞凋亡相关蛋白Fasl和caspase-3的表达,从分子及受体水平证实了中药复方宏观“杀胚”的效应。徐娟[55]在体外细胞模型的基础上建立了异位妊娠的裸鼠体内移植模型,为进一步的发病机制、药效物质基础等研究提供有效的研究载体,并发现化瘀消癥杀胚中药能够下调绒毛组织ER、PR表达,明显上调Bax蛋白表达的趋势,从而拮抗雌孕激素,促进细胞凋亡,引起绒毛组织变性、坏死,从分子、基因水平阐述了化瘀消癥杀胚中药对异位妊娠影响的可能调控机制。体内体外实验相互印证,进一步明确了化瘀消癥杀胚中药复方可能通过促进输卵管妊娠滋养细胞凋亡而达到杀胚治疗疾病的目的。

第三节 细胞凋亡及其信号传导通路

  细胞凋亡(apoptosis,Apo)又称程序性细胞死亡,广泛存在于多细胞生物的各种组织中,是多细胞生物保证个体正常发育成熟和在维持正常生理过程中起着重要作用,也是多细胞生物生存的必要条件,贯穿整个机体的生命过程[55]。
一、凋亡时细胞的主要变化
(一)细胞凋亡的形态学改变
凋亡细胞出现特征性的形态学改变包括:①异染色质密集,呈边缘化;②胞膜空泡化,核固缩;③DNA链断裂;④出现凋亡小体
(二)细胞凋亡的生化改变
凋亡细胞的典型生化改变是将其基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳时,核酸片段表现为间隔180~200 bp的阶梯状条带。

二、细胞凋亡的分子机制
  目前已知,细胞凋亡可分为caspase依赖和caspase不依赖两种机制,而caspase依赖的细胞凋亡又包括三种方式:①死亡受体介导的细胞凋亡(外源通路);②线粒体介导的细胞凋亡(内源通路);③内质网介导的细胞凋亡(内源通路)。目前研究进展发现caspase依赖的细胞凋亡占细胞凋亡的主导地位。死亡受体是肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的成员,其特点是具有富含Cys的胞外结构域和胞内死亡结构域DD(Death Domain) [57]。目前研究较清楚的死亡受体是Fas (也称CD95或Apol)和TNFR1(也称P53或CD120a) [58]凋亡信号起始于细胞膜,这些死亡受体通过结合特定的死亡配体,在结合后的几秒内可激活caspase蛋白激酶级联反应,并在几小时内诱导凋亡的发生。图一为死亡受体介导的细胞凋亡过程。

(一)Fas信号传导途径
  Fas基因,定位于人第10号染色体上,其编码产物为45kD的跨膜受体, Fas受体的分子结构可分为三个区,即具有三个富含半胱氨酸的胞外区、跨膜区和具有死亡结构域(DD)的胞内区。与TNF其他家族成员类似,FasL以同源三聚体复合物的形式存在FasL基因定位于人第1号染色体上,与TNF其他家族成员类似,FasL以同源三聚体复合物的形式存在,晶体结构分析表明,每一个FasL三聚体分子可结合三个Fas分子[58] 。Fas与其配体(FasL)的相互作用,导致Fas的胞内区DD结构域与接头蛋白FADD (Fas associated death domain protein)偶联,然后再通过FADD的死亡效应结构域(death effecter domain,DED)与caspase-8结合,Caspase-8通过自身降解而活化,然后激活其下游效应蛋白酶Caspase-9,使细胞走向凋亡[59-60]。

(二)线粒体介导的细胞凋亡
  线粒体是细胞的能量工厂,它提供真核细胞代谢所需要的能量, 多种物理、化学及生物学因素可导致线粒体外膜通透性增加,线粒体接受凋亡信号,加以整合,然后通过释放凋亡相关因子如细胞色素C,Smac,AIF等,这些分子通过激活Caspase依赖传导途径,从而触发细胞凋亡过程。
  1985年,Tsujimoto等将人18q21上涉及滤泡性淋巴瘤的一个癌基因定名为BCL-2,1988年,Vaux等发现其蛋白产物Bcl-2的功能不是增加细胞的增殖能力而是使细胞凋亡受阻。根据功能和结构可将Bcl-2家族分为两大类:抗凋亡的:如Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1等;促凋亡:如Bax、Bak、Bok。Bcl-2/Bax之间的比例平衡决定着凋亡的发生[61]。Bcl-2家族位于线粒体膜表面,可与促凋亡蛋白形成复合体,抑制其作用,因而具有拮抗促凋亡蛋白的功能。而大多数Bcl-2家族的促凋亡蛋白则主要定位于细胞浆,一旦细胞受到凋亡因子的诱导,即可向线粒体膜转位。这些促凋亡蛋白通过寡聚化,在线粒体外膜形成跨膜通道 ;或者开启线粒体的通透性转变孔(permeability transition pore,PT),促使线粒体内的凋亡因子(cyt c)释放,激活蛋白水解酶caspase,引发细胞凋亡。(见图3)

 

三、细胞凋亡和输卵管妊娠

  越来越多的研究者关注滋养细胞疾病与妊娠相关疾病的关系,越来越多的研究表明,正常妊娠过程中,滋养细胞、蜕膜的增殖和凋亡处于一个相对平衡状态,一旦平衡状态被打破,发生异常凋亡就可能导致病理妊娠的发生。
  丁峰等[62]研究认为Bcl-2/Bax共同参与正常早孕蜕膜细胞凋亡的调节,任何打破之间平衡的原因均可能导致妊娠失败。国外学者亦发现不明原因的复发性自然流产患者其滋养细胞凋亡增多[63]。Rangoa[64]等发现凋亡在输卵管妊娠中经常发生在绒毛膜而不是在底蜕膜中,且输卵管妊娠滋养细胞由于不同植入部位使母体微环境不同,外周绒毛滋养层细胞的旁分泌影响因素可能缺乏,结果凋亡的引导失败,引起外周绒毛滋养层细胞的无控制侵袭,这可能是诱发输卵管妊娠破裂的原因之一。Kucera[25]等发现输卵管妊娠破裂型阳性的Bcl-2染色带及强度较高,提示凋亡调节失衡,输卵管滋养层细胞的无限制增值。课题组在此基础上[52-54],研究活血化瘀消癥杀胚中药可降低输卵管妊娠绒毛组织Bcl-2 表达水平,从而阻碍了Bcl-2 的抗细胞凋亡的作用,促进了输卵管妊娠胚胎组织死亡;活血化瘀消癥杀胚中药可升高妊娠输卵管粘膜PR 表达水平,从而降低输卵管粘膜对于胚胎组织的容受性,导致胚胎死亡;活血化瘀消癥杀胚中药对妊娠输卵管粘膜细胞超微结构(微绒毛、线粒体、细胞核、内质网)均有明显影响,提示活血化瘀消癥杀胚中药能够影响妊娠输卵管粘膜细胞的生理代谢过程的正常进行,从而影响着床在输卵管的胚胎组织的营养供给,促进胚胎组织凋死亡。
  此外细胞凋亡和其他妊娠相关疾病亦紧密相关。施蕾[66]等认为子痫前期的发病原因可能与胎盘滋养叶细胞凋亡及Bcl-2、Fas基因异常表达有关。缺氧在是许多妊娠并发症的病因所在,许多研究者发现,缺氧是引发凋亡的主要因素,而缺氧导致的凋亡调控异常很可能是导致许多妊娠相关疾病的根本原因。

第二章  临床部分
一、研究对象
(一)病例来源
  病例103例均来自2012年1月至2013年12月于广州中医药大学第一附属医院妇科病房住院,符合“中西医结合”药物治疗规范,并自愿接受药物治疗的输卵管妊娠患者。
(二)病例选择
1. 异位妊娠的诊断标准
  根据国家中医药管理局医政司《24个专业105个并重中医诊疗方案》[67]拟定诊断标准,根据以下症状、体征和辅助检查综合判断,确诊异位妊娠。
(1)症状:有停经史或无明显停经史;下腹隐痛或剧烈疼痛(小部分可无下腹疼痛),或有不规则阴道流血。
(2)体征:贫血貌或面色苍白、脉快而细弱、血压下降。或下腹压痛、反跳痛。妇科检查:子宫常大或略大,一侧附件或可触及包块,有压痛。阴道后穹窿饱满、有触痛。宫颈有举痛或摇摆痛。
(3)辅助检查:β-HCG阳性;盆腔B超:宫内未见孕囊,宫旁出现液性或混合性回声区,或该区有胚芽或原始心管搏动,或宫旁回声区无输卵管妊娠声像特征,但腹腔内存在无回声暗区或直肠子宫陷凹处有积液。或后穹窿穿刺抽出不凝血。或诊断性刮宫及病检未见绒毛。
2. 纳入标准
  根据“输卵管妊娠辨病分期和辨证分型标准”对诊断为异位妊娠患者进行辨病分期和辨证分型,并根据“输卵管妊娠的病情影响因子评分模型”进行评分,选择适合中西医结合治疗的病例进行临床观察。
(1)符合诊断标准。
(2)患者入院后经输卵管妊娠的病情影响因子评分(见表2),并符合输卵管妊娠的中西医结合治疗方案总表(见表3)中中西医治疗范畴的患者。
(3)肝肾功能正常,凝血功能正常,外周血白细胞≥4×109/L,血小板≥100×109/L。
(4)自愿要求药物治疗,签署根据病情不同选择不同治疗方案的药物治疗知情同意书。


3. 排除标准
(1)不符合上述纳入标准者。                                                             
(2)严重心肝肾功能不全或有血液系统疾患者。
(3)输卵管妊娠合并宫内妊娠者。
(4)非输卵管性的异位妊娠。
(5)β-HCG阴性(滋养叶细胞已无活性)的输卵管妊娠患者。
(6)患者拒绝保守治疗或不配合者。
(三)分组方法
  将103例患者按照随机方法分为2组,即中药+甲氨蝶呤组、中药+米非司酮组,各组患者的患病高危因素、年龄分布、既往妊娠情况、停经天数、腹痛情况、阴道流血天数、异位妊娠包块情况及血β-HCG情况、子宫直肠陷凹积液深度比较如下:
1. 高危因素

11. 小结

  使用秩和检验和t检验(t-Test)表5、6、7、8、9、10、11、12、13中可见符合中西医结合治疗的中药+MTX、中药+米非司酮组在年龄、既往妊娠情况、停经天数、腹痛情况、阴道流血天数、异位妊娠包块情况及血β-HCG情况、子宫直肠陷凹积液深度及病情影响因子总积分比较,差异无统计学意义(P>0.05)。

二、研究方法
(一)研究设计方法
  采用前瞻性、无盲法、不等随机对照研究。
(二)干预措施
1. 基础中药:以活血化瘀,杀胚止痛为治法。
(1)基础治疗:宫外孕Ⅰ号方(丹参15g、赤芍15g、桃仁15g),每日1剂,再煎,日服两次。
(2)在基础方上辨证分型治疗:
  胎元阻络型:活血化瘀杀胚为主。可在宫外孕Ⅰ号方中选加蜈蚣(去头足)3条,紫草15g,天花粉20g,田七10g,或根据个体情况酌情加减。
  正虚血瘀型:益气养血,化瘀杀胚。可在宫外孕Ⅰ号方中选加党参15g,黄芪20g,鸡血藤30g,田七10g,蜈蚣(去头足)3条,紫草15g,天花粉20g,或根据个体情况酌情加减。
(3)散结镇痛胶囊,4粒,口服,一日三次(生产企业:江苏康缘药业股份有限公司,批文:国药准字Z20030127,规格:0.4g/粒,每盒30粒)。
(4)外敷药:广州中医药大学第一附属医院自制双柏散(侧柏叶、黄柏、大黄、薄荷、泽兰)100g,外敷双下腹,一日一次。
(5)丹参注射液,2Oml,静脉滴注,一日一次(生产企业:正大青春宝药业有限公司,批文:国药准字Z33020177,规格:10ml/支,6支/盒)。
2. 中药+甲氨蝶呤组
(1)中药治疗:同基础中药。
(2)选用甲氨蝶呤50mg/m2,单次肌肉注射,一次为一个疗程(生产企业:山西普德药业股份有限公司,批号:02110901,规格:100mg/支)。
3. 中药+米非司酮组
(1)中药治疗:同基础中药。
(2)米非司酮150mg口服,每日一次,连服5天(生产企业:湖北葛店人福药业有限责任公司,批文:国药准字H20033551,规格:25mg/片,6片/盒)。
(三)疗程
  治疗疗程以4周为上限。
(四)观察指标
1. 生命体征及临床症状:每日密切注意血压、脉搏、呼吸、体温等基础生命体征及腹痛、阴道流血、肛门坠胀感等临床症状。
2. 观察治疗过程中:每周检查2次血β-HCG定量,每周检查1次妇科B超。
3. 入院后检查血常规及肝肾功能1次,治疗结束时复查血常规及肝肾功能1次。
(五)药物治疗的疗效评定标准
1. 近期治愈:阴道流血停止,腹痛消失;妇科B超检查妊娠包块缩小1/2以上;β-HCG测定连续两次阴性。
2. 有效:阴道流血停止,腹痛消失;妇科B超检查妊娠包块缩小不到1/2或无增大;β-HCG测定连续两次阴性。
3. 无效:在保守治疗过程中出现异位妊娠破裂、内出血而急行手术者,或经2个疗程的治疗血β-HCG持续不下降或反而上升、异位妊娠包块不缩小而增大者。
(六)副反应判定标准[68]
1. 躯体不良反应:服药后患者新出现的症状和体征,如皮疹、发热、恶心、食欲不振、腹泻等。
2. 肝肾功能损害:谷丙转氨酶(ALT)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)异常。
3. 造血系统损害:白细胞计数下降至〈4×109/L,或血小板计数下降至〈100×109/L。
(七)统计方法
  用SPSS18.O统计软件。计量资料先进行正态性检验和方差齐性检验,满足要求两样本均数比较用t检验,未满足要求两样本均数比较用秩和检验;计数资料用χ2检验。
三、结果
(一)一般资料
1. 病例入选与临床试验完成情况
    共收集符合药物保守治疗输卵管妊娠患者103例,其中中药+MTX组54例,中药+米非司酮组49例。治疗过程中中药+MTX组3例因HCG值持续不降、腹痛剧烈中转手术,1例因包块增大中转手术,2例因HCG值升高中转手术;中药+米非司酮组3例因包块增大、HCG值下降不理想中转手术,2例因HCG值下降不理想加用MTX。
 (二)临床疗效研究结果
1. 两组有效率的比较
103例病例中,中药+MTX组54例,有效率为88.89%;中药+米非司酮组49例,有效率为89.80%。(表14,图四)

2. 有效病例腹痛消失时间的比较
  103例病例中,中药+MTX组54例,有效且初始有腹痛症状者39例;中药+米非司酮组49例,有效且初始有腹痛症状者26例。(表15)

3. 两组有效病例血β-HCG值下降至50%及10%时间比较103例病例中,中药+MTX组54例,有效者45例;中药+米非司酮组49例,有效者39例。(表16)

(三) 副反应评价
  在治疗过程中,两组治疗前后血常规中的白细胞、血小板及肾功能均在正常范围变化;中药+MTX组出现胃肠反应2例,中药外敷后出现局部皮肤瘙痒1例。不良反应对照处理和停药后均消失。
四、讨论

  近些年来,随着慢性盆腔炎性疾病、辅助生殖技术、女性吸烟人群的增加,异位妊娠的发生率显著增加[69],据报道,北美异位妊娠的发生率在妊娠人群中由1970年的0.5%,攀升到1992年的2%[69-72],异位妊娠破裂导致孕产妇死亡率约10%-15%。
  随着社会的发展,性意识的开放,异位妊娠发病年龄有逐渐年轻化趋势,本研究中25-29岁年龄段所占比例最高,约占38.8%,且大多数无生产史,故如何能在安全治愈疾病的同时最大限度的保留患者的生育能力,是现在异位妊娠治疗的热点和难点。近些年来,随着超声诊断、生化检查等技术的发展,异位妊娠的早期诊断得到了大大的提高,为临床药物治疗提供有利条件。有学者报道异位妊娠患者的生育力与治疗方法有关,药物保守治疗18个月后累计妊娠率达80%,高于根治性手术患者(57%),尤其对对侧输卵管异常的不孕患者,药物治疗比手术更有效。国内目前常用的药物治疗方法西药为甲氨蝶呤和米非司酮,中药多用活血化瘀消癥类加减辩证论治。前期临床研究及国内多数医家研究证实中药治疗异位妊娠疗效确切,尤其在促进盆腔包块缩小方面优势较大。袁烁[53]用化瘀消癥杀胚中药联合米非司酮治疗异位妊娠119例,发现中西医结合治疗可促绒毛失去活性,加速血HCG下降的速度,增加了输卵管妊娠药物保守治疗的成功率。徐娟用化瘀消癥杀胚中药+米非司酮及单用米非司酮治疗70例异位妊娠,其中中药+米非司酮组有效率为89.13%,米非司酮组有效率为70.83%,差异有统计学意义(P<0.05),两组包块缩小率上有显著差异(P<0.01)。王莉莉[73]用化瘀消癥汤联合甲氨蝶呤及单用甲氨蝶呤保守治疗异位妊娠115例,发现化瘀消癥汤联合甲氨蝶呤组与甲氨蝶呤组相比,可有效降低HCG水平,促进包块吸收,提高输卵管通畅性。中药与西药联合运用使疗效更高得到多数医家的肯定,但中药联合甲氨蝶呤和中药联合米非司酮其疗效有无差异,各有何优势,目前尚未见大量报道。
  本临床研究在课题组前期大量研究的基础上对比了中药+MTX与中药+米非司酮的疗效,为临床选择用药提供了一定依据。结果显示,中药+MTX组有效率为88.89%;中药+米非司酮组有效率为89.80%,两组疗效无明显差异;观察组血β-HCG值下降至50%的时间较中药+米非司酮组短,但两组总的降HCG水平方面效果相当;中药+MTX组在包块缩小程度方面优于中药+米非司酮组,提示中药+MTX较中药+米非司酮组在促进盆腔内包块吸收上有较大优势。治疗失败改手术的病人中,中药+MTX多因HCG持续不降甚至升高,中药+米非司酮组多因包块增大明显改手术治疗或加用MTX。
中药治疗以丹参、赤芍、桃仁为基础方,临症加减。现代研究证实大部分活血化瘀的药物有改善血液流变性、改善和调节微循环、促进凝血块分解吸收、杀胚及抑菌、消炎镇痛的作用[74-75]。
  本研究在胎元阻络型采用宫外孕Ⅰ号方加蜈蚣(去头足)3条,紫草15g,天花粉20g,田七10g为基础方,加强活血化瘀杀胚的功效;正虚血瘀型采用宫外孕Ⅰ号方加党参15g,黄芪20g,鸡血藤30g,田七10g,蜈蚣(去头足)3条,紫草15g,天花粉20g为基础方,加强益气养血,化瘀杀胚功效。
  胚胎着床后,HCG即由滋养层合体细胞合成并分泌,是妊娠的特异标志。HCG可吸附滋养细胞表面,是滋养细胞活力的一个重要指标,血液中该值的高低,在很大程度上反映了滋养细胞的生长状况,且滋养细胞侵袭性与滋养细胞的HCG水平相关[76-78]。在异位妊娠中,由于输卵管肌层菲薄,绒毛发育所需条件受限,影响滋养细胞增殖,故而异位妊娠血HCG较正常妊娠较低[79]。但并不影响其作为反映异位妊娠胚胎存活或滋养细胞活力的主要实验指标。
  MTX是叶酸拮抗剂,可与二氢叶酸还原酶结合,阻止二氢叶酸还原成具有生物活性的四氢叶酸,导致嘌呤和嘧啶的合成被抑制,从而干扰DNA和RNA及蛋白质合成产生细胞毒作用,抑制肿瘤细胞分裂增生。滋养细胞对MTX高度敏感,用药后可抑制滋养细胞增生,降低细胞活力和HCG分泌,破坏绒毛,使胚胎组织坏死、脱落、吸收。
  米非司酮是一种19-去甲睾酮的衍生物,具有抗孕激素和流产的作用,在受体水平起效。因其与孕酮受体的亲和力是体内孕酮的5倍,能与内源性孕酮竞争性结合受体,产生较强的抗孕酮作用,使妊娠黄体萎缩,引起蜕膜和绒毛萎缩,导致出血和HCG下降[80]。如果血HCG值下降,说明滋养细胞活性在减退,治疗后血清HCG下降越快,治疗越成功[81]。本研究治疗表明,两组病例HCG从峰值下降至50%的治疗天数中药+MTX较中药+米非司酮组快(P<0.05)。表明运用中药+MTX在前半治疗期间其抑制滋养细胞活性疗效较快,这可能与杀胚药物的作用机理和作用时效相关。HCG值从峰值的50%下降至10%的时间比较无明显差异,表明两种杀胚药物其最终的杀胚疗效相当。
  B超包块的大小,是传统沿用的一个保守治疗指标,输卵管妊娠病理研究表明,输卵管妊娠包块主要由滋养细胞侵入输卵管壁的血管,血凝块与妊娠物混合导致输卵管扩张形成,附件包块的大小不能反映滋养细胞侵入输卵管管壁的深度,但包块的消长情况却与成功密切相关,因此提倡作为动态变化的指标[82]。异位妊娠包块越大,其发生破裂导致病情巨变的风险越高,本研究发现中药+米非司酮组在缩小包块方面不如中药+MTX组,这可能因MTX直接作用于滋养细胞使其坏死,降低了其侵入输卵管管壁的程度,而米非司酮是通过黄体萎缩,导致蜕膜变性坏死出血有关。
五、小结

  综上,中西医结合治疗异位妊娠疗效确切,中药+MTX在缩小包块方面疗效优于中药+米非司酮组,在HCG值下降、阴道流血、腹痛消失等方面疗效相当。

第三章  实验研究

  异位妊娠(Ectopic pregnancy,EP)指受精卵在子宫腔以外的部位着床发育,其中超过95%患者的为输卵管妊娠[1]。输卵管妊娠是最常见的妇产科急腹症,占妇科急症的80%以上,首诊延误率可高达40%,是孕早期死亡的主要原因之一。近些年来,输卵管妊娠的发病率呈逐年上升的趋势,呈发病率高、误诊率高、死亡率高的“三高”现象,严重威胁育龄妇女的生命健康。
  中医公认异位妊娠的发病机理是少腹血瘀证[2],采用活血化瘀、消癥杀胚方药治疗早期输卵管妊娠疗效确切。早在1958年山西医学院第一附属医院首先使用宫外孕Ⅰ号、Ⅱ号方保守治疗异位妊娠,取得突破性进展。化瘀消癥杀胚中药复方是根据中医理论而制定,由丹参、赤芍、桃仁、天花粉、紫草五味药组成,是宫外孕Ⅰ号方衍化而来,临床上应用化瘀消癥杀胚中药复方治疗早期输卵管妊娠成功率达88.9%[3],最大限度保全了患者的生育功能,提高了生活质量。课题组前期研究发现化瘀消癥杀胚中药可降低输卵管妊娠绒毛组织Bcl-2表达水平、升高妊娠输卵管粘膜ER表达水平,并对输卵管妊娠粘膜细胞超微结构(微绒毛、线粒体、细胞核、内质网)均有明显影响,通过促凋亡、影响营养供给等途径促进胚胎死亡[52]。体外实验研究发现化瘀消癥杀胚中药复方可降低输卵管妊娠滋养细胞的侵袭能力、显著降低输卵管妊娠滋养细胞ER、PRm-RNA的表达、可增加输卵管妊娠滋养细胞凋亡相关蛋白Fasl和caspase-3的表达,从分子及受体水平证实了中药复方宏观“杀胚”的效应[54]。在此基础上,徐娟运用人源绒毛组织块移植法成功地建立了异位妊娠裸鼠体内移植模型,并采用qRT-PCR、western-blot技术,从分子和基因水平阐述了化瘀消癥杀胚中药有促进滋养细胞凋亡,促进绒毛组织坏死的作用[55]。
前期大量临床实验和体外实验均证实了化瘀消癥杀胚中药复方有促进输卵管妊娠滋养细胞凋亡从而达到治疗异位妊娠的目的,前期体外实验发现输卵管妊娠滋养细胞与正常宫内早孕滋养细胞的生长周期、扫描电镜下二者外观形态无明显差异及二者侵袭能力均无明显差异[54],而化瘀消癥杀胚中药复方可能通过促进滋养细胞凋亡而达到治疗输卵管妊娠的目的,那么它是否对宫内正常妊娠的滋养细胞亦有促凋亡作用? 其促凋亡是通过何种途径实现的?本实验在前期研究的基础上,比较输卵管妊娠滋养细胞和宫内早期妊娠滋养细胞外观形态及生长曲线的异同,探讨化瘀消癥杀胚中药复方对两种滋养细胞凋亡的形态学、凋亡率及细胞凋亡通路影响。

 
第一节  输卵管妊娠滋养细胞及宫内早孕滋养细胞的培养
一、标本来源
(一) 输卵管妊娠绒毛组织:
选取2013.5-2013.8在广州中医药大学第一附属医院妇科病区住院的输卵管妊娠手术患者绒毛组织,严格遵循以下诊断标准、纳入标准及排除标准,并取得其知情同意。
1. 诊断标准
(1)症状:有停经史或无明显停经史;下腹隐痛或剧烈疼痛(小部分可无下腹疼痛),或有不规则阴道流血。
(2)体征:贫血貌或面色苍白、脉快而细弱、血压下降。或下腹压痛、反跳痛。妇科检查:子宫常大或略大,一侧附件或可触及包块,有压痛。阴道后穹窿饱满、有触痛。宫颈有举痛或摇摆痛。
(3)辅助检查:β-HCG阳性;盆腔B超:宫内未见孕囊,宫旁出现液性或混合性回声区,或该区有胚芽或原始心管搏动,或宫旁回声区无输卵管妊娠声像特征,但腹腔内存在无回声暗区或直肠子宫陷凹处有积液。或后穹窿穿刺抽出不凝血。或诊断性刮宫及病检未见绒毛。
2. 纳入标准:
(1)符合诊断标准
(2)患者未服用药物,直接要求手术;或因输卵管妊娠破裂、流产而行急诊手术治疗者。
(3)已签署许可收集绒毛的知情同意书。
3. 排除标准:
(1)不符合诊断标准及纳入标准者
(2)非输卵管妊娠的异位妊娠患者
(3)术前曾经药物治疗干预过的患者
(二)宫内妊娠绒毛组织
  选取2013.5-2013.8在广州中医药大学第一附属医院妇科门诊自愿终止妊娠、年龄20-35岁健康宫内正常妊娠6-8周妇女,妊娠期间无其他疾病及用药史,并取得其知情同意。
二、材料与方法
(一)主要试剂与仪器
DMEM/F12培养基:美国Gibico公司,LOT:8113324
胎牛血清:美国Gibico公司,LOT:1365340
25%胰蛋白酶(含EDTA):美国Gibico公司,LOT:1255886
I型胶原酶:Sigma公司,货号:C-0130
Percoll分离液:BIOSHARP, LOT:10055500
Hanks’(10×):Sigma公司,LOT:RNBC1413
HBSS(1×):美国Gibico公司,LOT:1257347
双抗(青霉素、链霉素):Hyclone公司,货号:SC30010
磷酸盐缓冲液(1×):Hyclone公司,LOT:NYB0812
一抗:Anti-Vimentin antibody(LOT:GR33451-1)、Anti-Cytokeratin 18 antibody(LOT:GR63386-2)、Anti-ErbB 2 antibody(LOT:GR100248-1)。英国abcam公司
荧光标记二抗:Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG(H+L), A11001;
Alexa Fluor 488 goat anti-Rabbit IgG(H+L), A11008; Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG(H+L), A11005;Alexa Fluor 594 goat anti-Rabbit IgG(H+L), A11012。Promega公司
Triton: Sigma公司,货号:T8787
山羊血清(Goat Serum, New Zealand Origin):life technologies公司, LOT:16210-064
抗荧光淬灭封片剂(ProLong Gold antifade reagent with DAPI, Invitrogen Molecular Probes):life technologies公司,LOT:P36931
CO2培养箱:英国RS Biotech公司 30K6A3091
电热恒温热水箱: 科大创新股份有限公司中佳分公司SSW-420-2S
超纯水机: 德国Sartorius公司  FC500MCL
电热鼓风干燥箱:上海一恒科学仪器有限公司 DHG-9053A
低速离心机:科大创新股份有限公司中佳分公司  SC-3610
高速离心机:科大创新股份有限公司中佳分公司  HC-2062
倒置荧光显微镜:日本Nikon EclipseTi-s  534138
高压灭菌锅:Hirayama  HVE-50
细胞自动计数仪:美国CELLOMETER公司  T4-203-0498
制冰机:美国 Grant公司   XB70
电子天平:德国Sartorius公司  BSA124
培养瓶、培养板、离心管:美国corning公司
酒精灯、移液器、烧杯、筛网、眼科剪、镊子等。
100%Percoll分离液的配置:90%Percoll原液+10×Hanks充分混匀。
60%Percoll分离液的配置:100%Percoll分离液6份+1×Hanks4份,充分混匀。
30%Percoll分离液的配置:100%Percoll分离液3份+1×Hanks7份,充分混匀。
(二)实验方法
1. 取材
  无菌条件下取新鲜的输卵管患者及宫内早孕患者术中绒毛组织,放入预冷的4℃PBS中冰上快速运回实验室,在超净工作台上用4℃PBS冲洗3次,冲洗过程中去除血污。
2. 绒毛组织滋养层细胞的分离
  眼科剪及镊子去除未冲净的血污,剪碎至1-3mm3,加入3倍体积PBS, 800r/min离心5min,弃上清。加入等体积的25%胰蛋白酶及Ⅰ型胶原酶后,于37℃恒温水浴箱内振荡消化15-20min,在显微镜下观察见少量漂浮的圆形细胞,组织内大量颗粒状细胞清晰可见,即加入等体积含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化,吹打1min,肉眼见培养基变浑浊,残存绒毛组织多为细条状白色纤维带。收集上清,200目孔径不锈钢滤网过滤。滤液置于50ml离心管中,800r/min离心5min,弃上清,加入3倍体积无血清DMEM/F12清洗一次,800r/min离心5min,弃上清,去除残存的消化酶。无血清DMEM/F12悬浮至3ml。
3. 滋养细胞的纯化
  用Percoll密度梯度法纯化。预先用60%、30%Percoll液各3ml缓慢加入15ml离心管中,60%Percoll液在下,30%Percoll液在上,再将分离所得细胞悬液缓慢加入预先铺好Percoll液的离心管中,使离心管出现三个液面层,1500 r/min离心20min。小心吸取60%、30%Percoll液中层的云雾状细胞条带置于50ml离心管内,加入4倍体积无血清的DMEM/F12,800r/min离心5min,弃上清;细胞计数仪计数,以无血清的DMEM/F12培养基调整细胞数为1×106 个细胞/ml接种于25cm2培养瓶中,置于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养,1h后取出换瓶,加入等体积含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基继续培养。24h首次换液,后每隔48h换液一次。
4. 滋养细胞传代
  当细胞长满瓶底90%时传代,用PBS清洗2次,加入1mL0.25%胰酶的消化液进行消化,37℃孵育3-5min,镜下观察见细胞触角回缩变圆,间隙变大,少量细胞悬浮时加入等体积含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化,轻轻晃动瓶身,轻柔吹打,镜下观察90%以上细胞悬浮,吸出细胞悬浮液置于15ml离心管中800r/min离心5min,弃上清。用含10%胎牛血清的DMEM/F12重悬,按1:2比例接种于25cm2培养瓶中继续于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养。
5. 免疫荧光细胞化学染色法细胞鉴定
  传代至第四代,将细胞接种于预先放有盖玻片(多聚赖氨酸包被过)的六孔板中继续培养,待细胞长满70%-80%后取出,用温PBS清洗3次,用4℃的甲醛固定15min;用预冷的PBS洗3次,再用0.1%trition室温透膜5min;PBS洗3次后每孔加入1ml 5%山羊血清封闭,室温孵育20min;去血清,分别滴加100μl稀释的(1:100)Cytokeratin18抗体、Anti-C-erbB-2抗体和Vimentin抗体(阴性对照组用PBS代替一抗),室温孵育1h;PBS洗3次,滴加稀释的荧光二抗,室温避光孵育1h;PBS洗3次,滴加DAPI的抗荧光淬灭封片剂滴于载玻片上,封固,置于-20℃过夜凝固;激光共聚焦显微镜上计算纯度。
6. 绘制细胞生长曲线
  取第四代生长状态良好的细胞,细胞计数仪计数后,稀释将浓度调整到1×105个细胞/ml,接种入12孔板。从次日起开始每日取3孔细胞用细胞计数仪计数,取平均值,连续6天,绘制出细胞的生长曲线。
三、结果
(一)两种滋养细胞原代培养、形态学观察和生长特性
绒毛组织消化时可见紧密排列的圆形细胞,分离纯化后的圆形细胞大而均一,24h后大部分细胞贴壁,悬浮的多为形态较小的血细胞,48h后可见少量散在细胞伸展,7天后细胞数量明显增多,细胞呈三角形、类圆形,胞核较大,胞浆丰富,部分联合成片,呈铺路石子样。原代生长较慢,约20天-30天长满90%,可以传代。原代培养细胞多夹杂成纤维细胞,传代时先回缩变圆多为成纤维细胞,其他细胞约3-5min脱壁,传代后细胞生长速度明显增加,约4天-7天爬满瓶底。输卵管妊娠滋养细胞与正常宫内早孕滋养细胞外观上未见明显形态学差异,原代培养输卵管妊娠滋养细胞生长较宫内早孕滋养细胞较慢,但传代后生长速度相同。倒置显微镜下细胞形态见附图一-二。
(二)免疫荧光细胞化学染色法鉴定细胞
  体外培养的滋养细胞表达抗CK-18阳性、Anti-C-erbB-2阳性,染色后胞浆分别呈荧光绿色和红色;抗Vimentin阴性,胞浆不染色。细胞核染色荧光蓝色,按上述方法检测分离纯化后的滋养细胞纯度为90%以上,可用于下一步实验。结果见表18及附图三-四.

(三) 两种滋养细胞生长曲线
  正常宫内妊娠滋养细胞和输卵管妊娠滋养细胞生长周期趋势大致相同,均在第3-4天时达对数生长周期,之后因细胞生长密度抑制作用进入平台期。结果见图五。

四、讨论
(一)宫内早孕滋养细胞和人输卵管妊娠滋养细胞模型建立的价值
  体外实验以其实验条件和外界影响因素易于控制且可避免体内实验的伦理学问题等优势在现代医学发展中起到至关重要的作用,细胞是一切生物体结构和功能的基本单位,具备生命个体固有的遗传信息和功能特性,因此细胞培养是体外实验的最好工具。人类滋养细胞体外模型的建立是研究滋养细胞相关疾病发展、治疗及转归的重要工具。中药复方成分复杂,作用靶点多样,影响因素繁多,而体外培养的细胞与体内细胞性状相似,是检测药物作用机理较好的实验对象。
(二)滋养细胞的原代培养及分离、传代
  国内外体外滋养细胞的培养大致分为组织贴块法和酶消化法。组织块培养法简单易行,但原代细胞生长周期长,所得目标细胞量少,难以纯化。酶消化分离法包括胰酶、胶原酶和Dnase酶消化法等[83],目前大多数学者采用酶消化法[84] ,可在短时间内得到大量高纯度的细胞,但必须严格掌控胰酶的浓度和消化时间,减少细胞损伤。本实验采用胶原酶、胰酶联合消化法,减少了胰酶对细胞的损伤。妊娠早期的绒毛组织主要为滋养层细胞、成纤维细胞,夹杂少量血管内皮细胞、Hofbauer细胞及血细胞等[85],如何排除其它细胞成分而保留所需成分是培养成功的关键,目前滋养细胞纯化的方法有BSA梯度法、Percoll密度梯度离心法、差异贴壁法、淋巴细胞分离液法等。其中以Kliman[86]等的Percoll连续密度梯度分离纯化法最为经典,此方法分离纯化滋养层细胞的纯度可达90%以上[87],且细胞形态完整,活性好,功能高,但操作步骤繁琐,容易污染且费用较高。文献报道滋养层细胞在Percoll中所处的密度为1048-1062g/L,而成纤维细胞在Percoll中所处的密度为1035g/L以下[88],白菡[89]等以此为依据,将分离梯度简化为2层,即30%(密度为1040g/L)60%(密度为1080g/L), 成功分离滋养层细胞,其纯度达94%以上,方法简便、可靠,可得到较多的原代细胞。本实验滋养细胞的原代培养用简化后的Percoll法分离纯化,再利用细胞对胰酶敏感性不同及贴壁速度不同在传代时进行滋养细胞纯化,此外Hofbauer细胞及血细胞均属非贴壁细胞,在换液过程中皆可除去。重复以上操作,传至4代时爬片鉴定。
(三)输卵管妊娠及正常宫内早孕滋养细胞的鉴定
  滋养层细胞主要与由间质分化来的成纤维细胞相鉴定,目前国际上尚无统一的标准,研究者们多从细胞形态结构、细胞骨架、细胞功能等几个方面进行鉴定。从倒置显微镜下观察细胞的形态和生长特性可粗略进行区分,通常情况下体外培养的滋养层细胞为扁平的多角形或三角形,呈片状生长,而成纤维细胞呈梭形,网格状生长。但因细胞形态受环境条件影响较大,所以细胞鉴定还需要依靠免疫细胞化学染色方法鉴别,较认同的分子标志有细胞角蛋白和波形蛋白[90]。滋养层细胞是人胚胎绒毛组织中唯一的上皮样细胞,而角蛋白是构成上皮细胞骨架蛋白,波形蛋白是间质细胞的标志蛋白,故可借此将滋养层细胞和间质细胞区分开[94]。但近些年来有些研究者发现来源于间质的滋养层细胞中波形蛋白亦可表达阳性[92-93]。cerbB-2是某些具有侵袭功能细胞的标志蛋白,而绒毛外滋养细胞(extravillous cytotrophoblasts,EVCT)是绒毛组织中唯一具有侵袭性的上皮细胞,可特异性的表达cerbB-2[94]。我们对细胞进行角蛋白、波形蛋白及cerbB-2免疫荧光染色,鉴定结果表明经Percoll密度梯度离心法联合差异贴壁法培养的滋养层细胞纯度达90%以上,符合实验要求。

五、小结

  输卵管妊娠滋养细胞和宫内妊娠滋养细胞在形态和增殖能力上并无显著的差异,其生长特性相似。胰酶胶原酶联合消化法培养的滋养细胞性能稳定,后续研究选择4-5代作为药物干预模型。
第二节  多种实验方法证实化瘀消癥杀胚中药复方对体外培养输卵管妊娠及宫内早孕滋养细胞凋亡诱导作用
  细胞增殖是生物体重要的生命特征,细胞以分裂方式进行增殖,用以补充体内衰老和死亡的细胞,是生物体生长、发育、繁殖以及遗传的基础。细胞凋亡是指为维持内环境稳定,由基因控制的细胞自主有序的死亡,它涉及一系列基因激活、表达以及调控等的作用,是为更好适应生存环境[95]。细胞增殖和细胞凋亡与输卵管妊娠疾病的发展密切相关。本部分的研究目的是通过体外实验,明确化瘀消癥杀胚中药复方对输卵管妊娠及宫内早孕滋养细胞增殖和凋亡的影响,并筛选出抑制滋养细胞生长及促进其凋亡的最佳用药浓度,通过不同方法观察细胞凋亡的形态学变化。
一、材料与方法
(一)实验细胞
输卵管妊娠及宫内早孕滋养细胞,具体培养方法见第一节。
(二)材料
1. 主要试剂
CCK8:南京建成公司,货号:A311-01
Annexin V-FTTC细胞凋亡试剂盒:上海贝博生物公司,LOT:BB130031
Hoechst33342:Sigma公司 货号30017
余细胞培养试剂同第一节。
2. 实验用药
甲氨蝶呤:Sigma公司,货号:06563,规格:5MG
中药饮片购自广州中医药大学第一附属医院药剂科(见表19)。

3. 主要仪器
套式恒温器 巩义市予华仪器有限公司  PTHW
旋转蒸发仪  巩义市予华仪器有限公司  RE-2000E
酶标仪:美国Thermo公司   Multiskan FC
脱色摇床:海门市其林贝儿尔公司  TS-2000A
透射电子显微镜:日本日立公司   H-7650
超薄切片机:日本日立公司  LEICA EM UC7
流式细胞仪:美国Beckman公司 FC500
高速冷冻离心机:美国sigma公司  3K30
圆底烧瓶、冷凝管、烧杯、量筒等若干  四川蜀牛玻璃仪器公司
余实验仪器同第一节
(三)方法
1. 实验组药物的配置
(1)化瘀消癥杀胚中药复方水提液的制备
  全方的药物组成:丹参15g、赤芍15g、桃仁15g、紫草15g、天花粉15g。取原方2剂,共150g,将药材粉碎成粗粉,加8倍药物体积水置于2000ml圆底烧瓶中,侵泡30min后,电热套100℃加热,回流提取2次,每次微沸后再煎煮1h,棉花过滤,合并2次滤液。将所得滤液于旋转蒸发仪上减压浓缩至1000m,得150mg/ml浓缩液,调PH值至中性,过纸膜,分装-20℃保存。使用前室温溶解,过0.22目滤网,用无血清的DMEM/F12培养基稀释成5mg/ml,10 mg/ml,20 mg/ml,30 mg/ml,40 mg/ml,现配现用。
(2)对照组药物的配制
  甲氨蝶呤(MTX)-阳性对照组:将甲氨蝶呤溶于用无血清的DMEM/F12,过0.22目滤网,配制成浓度为1mg/ml,分装冻存。使用时再用无血清的DMEM/F12稀释成5ug/ml,现配现用。
阴性对照组:无血清的DMEM/F12培养基。

(3)中西药结合组:中药复方中剂量(10mg/ml)与甲氨蝶呤1ug/ml联合使用,配制方法同上。
2. 化瘀消癥杀胚中药复方对两种滋养细胞生长的影响
  将生长状态良好的细胞以培养液制成5×105/ml单细胞悬液,每孔100μl接种于96孔培养板内(最后一列孔为无细胞的空白调零组),观察细胞贴壁且生长状态良好,用不含血清的DMEM/F12继续培养细胞24h后,加入新鲜配制的化瘀消癥杀胚中药5mg/ml,10 mg/ml,20 mg/ml,30 mg/ml,40 mg/ml,每组设6个复孔,同时设阴性对照组,平行接种于6块培养板上,每天换液。分别继续培养1-6天,每天同一时间取一块板,弃旧培养基,PBS清洗2次,每孔加入90μl的培养基和10μl的CCK8试剂(尽量不要在孔中产生气泡),将培养板在培养箱内孵育4h。用酶标仪在450nm处测定各孔吸光值(OD),以空白调零组去除CCK8试剂本身的OD值所带来的误差。记录结果,计算各实验分组细胞生长抑制率(%)=(1-实验组吸光度/对照组吸光度)×100%。以时间为横坐标,细胞生长抑制率为纵坐标绘制不同给药时间、不同给药浓度药物作用后的细胞生长抑制曲线,并确定中药作用时间及高中低组的剂量。
3. Hoechst染色法观察化瘀消癥杀胚中药复方对两种细胞形态学的影响
  将滋养细胞接种于6孔板中,待细胞长满80%时,根据实验分组(中药高剂量组20mg/ml、中剂量组10mg/ml、低剂量组5mg/ml,甲氨蝶呤组,中药+甲氨蝶呤组,阴性对照组),37℃孵育48h;弃上清,PBS冲洗2次,加入0.5ml Hoechst(用DMEM/F12培养基按1:1000比例稀释),37℃避光孵育30min,PBS冲洗2次,置倒置荧光显微镜下观察,荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。
4. 化瘀消癥杀胚中药复方对两种滋养细胞超微结构影响的透射电镜观察
  将生长状态良好的滋养细胞以1×105个/ml每孔1ml接种于6孔板内,37℃,5% CO2恒温培养箱中培养,观察细胞贴壁且生长状态良好后,用不含血清的DMEM/F12继续培养细胞24h后,根据实验分组(中药高剂量组20mg/ml、中剂量组10mg/ml、低剂量组5mg/ml,甲氨蝶呤组,中药+甲氨蝶呤组,阴性对照组),加入新鲜配制的含药培养基共培养48h。
(1)前固定:常规消化,PBS清洗2次,最后一次清洗收集于EP管中,1000r/min离心5分组,弃上清,加入2.5~3%戊二醛,4℃固定2~4h。
(2)0.1mol/L PBS漂洗2次,每次10min.
(3)后固定:1%锇酸1.5~2h,0.1mol/L PBS漂洗2次,每次5min。
(4)脱水:50%、70%乙醇逐级脱水1次,每级10min,80%、90%、100%丙酮逐级脱水2次,每级10min。
(5)置换;100%丙酮:环氧树脂Epon812包埋剂以1:1混合,置换40min。
(6)浸透:环氧树脂Epon812包埋剂37℃浸透过夜。
(7)包埋:将组织置包埋模内Epon812包埋剂包埋,60℃聚合48h。
(8)在解剖显微镜下修块,将组织块表面修平整,暴露组织并根据组织表面的形状修成梯形、正方形或长方形。
(9)超薄切片:在AO超薄切片机下切40~60nm的超薄切片,用铜网捞片。
(10)电子染色:70%乙醇配制的饱和醋酸铀染色3min,双蒸水漂洗,铅染液染3min,双蒸水漂洗。
(11)干燥后电镜观察。
5. 流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测药物干预后两种滋养细胞的凋亡率
  将对数生长期的两种滋养细胞加入无血清的DMEM/F12培养液,于37℃、5%CO2培养箱中继续培养24h,弃培养基,根据实验分组(中药高剂量组20mg/ml、中剂量组10mg/ml、低剂量组5mg/ml,甲氨蝶呤组,中药+甲氨蝶呤组,阴性对照组)。加药后按常规条件培养48h后,PBS洗涤细胞2次,加入适量胰蛋白酶消化,收集细胞悬液, 1000r/min 4℃低温离心5分钟,弃上清;加入预冷的PBS洗涤2次后每管加入400μl Binding Buffer重悬后,加入5μl Annexin V-FTTC,4℃避光孵育15min后加10μl PI 4℃避光孵育5min,混匀上流式细胞仪检测。
6. 统计学处理
  以上实验至少重复3次,统计学处理采用统计软件包SPSS17.0,数据均以 表示,药物组间比较采用完全随机设计的方差分析,以P<0.05为有统计学意义。
二、结果
(一)CCK8法检测各实验组对两种滋养细胞的生长抑制作用
1. 化瘀消癥杀胚中药复方对两种滋养细胞的生长抑制作用
经过终浓度为5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml的化瘀消癥杀胚中药处理后的两种滋养细胞,不同作用时间对其的生长抑制作用各不同。(表20-21)

2. 化瘀消癥杀胚中药对两种滋养细胞时间、剂量变化的量效关系曲线

  化瘀消癥杀胚中药对输卵管妊娠滋养细胞的量效关系拟合方程式为Y=-10.325+9.048×时间(天)+1.592×剂量,(P<0.05,Y为抑制率),由方程式与曲线图六分析表明化瘀消癥杀胚中药作用不同时间、不同剂量对输卵管妊娠滋养细胞的抑制率呈正相关性,随着时间、剂量的增大,对其生长抑制率增大(效应增强),且剂量对滋养细胞的生长抑制作用大于时间对其的作用。

  化瘀消癥杀胚中药对宫内妊娠滋养细胞的量效关系拟合方程式为Y=-1.922+7.255×时间(天)+1.723×剂量,(P<0.05,Y为抑制率),由方程式与曲线图七分析表明化瘀消癥杀胚中药作用不同时间、不同剂量对宫内妊娠滋养细胞的抑制率呈正相关性,随着时间、剂量的增大,对其生长抑制率增大(效应增强),且剂量对滋养细胞的生长抑制作用大于时间对其的作用。
3. 化瘀消癥杀胚中药作用时间、浓度的确定
  化瘀消癥杀胚中药作用两种滋养细胞48h后,随着药物浓度的增加,两种滋养细胞的抑制曲线无明显差异(P>0.05)(见图八),根据指数递减方程y=A1*exp(-x/t1)+y0和药物浓度作用曲线,可算出化瘀杀胚中药复方对输卵管妊娠滋养细胞作用48h的半数最大抑制浓度:IC50=20.12mg/ml;对宫内妊娠滋养细胞作用48h的半数最大抑制浓度:IC50=23.98mg/ml。以此为依据,以下实验中药浓度分高剂量组20mg/ml、中剂量组10mg/ml、低剂量组5mg/ml。

(二)细胞凋亡的形态学评价
  倒置荧光显微镜下观察可见,不同浓度中药复方组中均出现不同程度核固缩、核碎裂及凋亡小体,以中药高剂量组20 mg/ml、中药+甲氨蝶呤组最明显。输卵管妊娠滋养细胞和宫内妊娠滋养细胞的凋亡形态无明显差异。见附图五-六。
(三)化瘀消癥杀胚中药复方对两种细胞超微结构的影响
  正常阴性对照组中的两种细胞均可见细胞表面微绒毛丰富,核仁大而明显,呈多样性,常染色质为主,胞质丰富,内质网扩张明显,高尔基体上有丰富的糖原颗粒,髓样小体,可见脂滴,两细胞连接处可见细胞桥连。
  各药物组作用48h后,观察滋养细胞表面微绒毛减少,体积变小、不同程度皱缩,常染色质变少,异染色质增多,集中在核仁边缘,或核仁萎缩、破裂,个别形成凋亡小体,内质网扩张呈泡状,与质膜融合,细胞器外渗、肿胀、细胞质内空泡状脂滴显著增多。两种滋养细胞的凋亡形态无明显差异。见附图七-八。
(四)化瘀消癥杀胚中药复方对两种滋养细胞凋亡率的影响
  凋亡率也相应增加,其中中药高、中剂量组凋亡率明显增加(P<0.01);与甲氨蝶呤组相比,中药高剂量组凋亡率增加(P<0.05),而中药+甲氨蝶呤组与中药高剂量组凋亡率无明显差异。见附图九,表22。

  各药物组作用于宫内滋养细胞48h后,与空白组相比,随着药物浓度的增加,细胞凋亡率也相应增加,其中中药高剂量组凋亡率明显增加(P<0.01);在输卵管妊娠滋养细胞中,中药高剂量组凋亡率较甲氨蝶呤组增加,与中药+甲氨蝶呤组相比凋亡率无明显差异(P>0.05)(见附图十,表23)。两种细胞各个浓度的细胞凋亡率相比,并无明显差异(P>0.05)(见图九)

注:1:阴性对照组 2:中药低剂量组5mg/ml 3: 中药中剂量组10mg/ml 4: 中药高剂量组20mg/ml
5:甲氨蝶呤组 6: 中药+甲氨蝶呤组
三、讨论
(一)化瘀消癥杀胚中药复方干预浓度的筛选
  CCK-8法是用于测定细胞增殖或毒性实验中活细胞数目的一种高灵敏度、无放射性的比色检测法,可替代传统的MTT法。因其灵敏度高、重复性好、操作简变被广泛应用于一些生物活性因子的检测、细胞毒性实验、大规模的抗肿瘤药物筛选以及肿瘤放射敏感性测定等。
  本次实验首选进行了中药组水提液用药浓度的筛选,根据CCK-8的结果可以看出各组药物对滋养细胞增殖呈时间、浓度依赖性,输卵管妊娠滋养细胞与宫内滋养细胞抑制率大致相同。而30mg/ml、40 mg/ml剂量组细胞毒作用较大,作用24h后抑制率大于50%,20 mg/ml剂量组在作用后48h后其输卵管妊娠滋养细胞与宫内滋养细胞抑制率分别为49.7%、41.7%,故选用20mg/ml剂量组为中药高剂量组。
  目前西药保守治疗异位妊娠多用甲氨蝶呤和米非司酮,滋养细胞对甲氨蝶呤敏感度高,且国外文献报道用甲氨蝶呤治疗异位妊娠为主流趋势,故本实验选择甲氨蝶呤作为阳性对照药。Kodithuwakku等在研究免疫因子Olfactomedin-1激活Wnt通路促进输卵管妊娠发展的研究中用MTX 5ug/ml作为阳性对照药[96]。陈亚侠[97]等在绒毛膜癌耐药株的研究中发现当MTX 浓度为5ug/ml对耐药的绒毛膜癌细胞株有明显的促凋亡作用,在大量文献研究的基础上,本实验选用甲氨蝶呤 5ug/ml为阳性对照药物组。
(二)化瘀消癥杀胚中药复方对两种细胞凋亡的影响
  细胞凋亡是1972年由Kerr首先提出来,是一种有具有标志性的形态学改变及生物化学特征(凋亡小体)的细胞死亡方式,亦称程序性细胞死亡。细胞凋亡存在的生理意义是清除过度增生、机体不再需要或已发生突变的细胞,以及清除攻击自身组织的免疫细胞等,从而使机体处于动态平衡的正常状态。Kokawa[98]等在输卵管妊娠绒毛和蜕膜中检测到特征性的细胞凋亡DNA梯状条带,认为凋亡主要位于滋养细胞,这与妊娠早期滋养细胞主要表达促凋亡基因有关。现代研究表明,细胞凋亡对疾病的发生、发展及药物治疗有极为重要的影响,尤其对中医中药来讲,诱导或抑制细胞凋亡成为阐述其治疗作用的主要手段,揭示了中药治疗疾病的途径,与现代医学相接轨。
  检测细胞凋亡的方法多样,主要包括形态学观察和生化检测方法,形态学观察是鉴定细胞凋亡最可靠的方法,包括细胞染色法、透射电镜、荧光显微镜法等,其中细胞染色法简单易行,透射电镜可观察细胞的超微结构。但形态学观察只能定性而不能定量,生化检测方法弥补了这一不足,其中包括TUNEL法、琼脂凝胶电泳技术、Annexin V-FITC凋亡检测方法,其中Annexin V对早期凋亡敏感性最强,结合PI双染可以区分早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞以及坏死细胞,采用流式细胞仪进行定量检测。
  本实验通过Hoechst染色、透射电镜对化瘀消癥杀胚中药复方作用两种滋养细胞后的凋亡形态进行观察,发现两种细胞在正常状态时的大致形态和超微结构大致相同,凋亡形态亦无明显差异。流式细胞仪Annexin V-FITC/PI法检测两种细胞凋亡率发现,中药中、高剂量组凋亡率明显增加(P<0.05),而与中药+甲氨蝶呤组、甲氨蝶呤组并无明显差异(P>0.05),两种细胞在不同药物浓度作用下凋亡率大致相同(P>0.05)。
  化瘀消癥杀胚中药复方由丹参、赤芍、红花、天花粉、紫草组成。现代药理学研究发现丹参[99]具有抗凝、促纤溶;扩血管;改善微循环;抗肿瘤等药理作用。赤芍具有 [100]抑制血小板和红细胞聚集、抗凝和抗血栓、抗肿瘤等作用。桃仁具有扩张血管、抗血栓、抗凝血、抗肿瘤、抗炎等作用[101]。天花粉、紫草为抗生育的药物,天花粉是从我国传统中药葫芦科植物栝楼的块根中提取的,天花粉结晶蛋白直接、专一、迅速作用于胎盘合体滋养细胞,促进核糖体失活,抑制胞内蛋白质合成,导致滋养层变性坏死,胚胎组织死亡[58];紫草够降低血清HCG水平,抑制黄体发育,阻碍破坏绒毛生长[102]。国内医家对这五种药物的作用亦做了大量的研究,秦文平[103]等应用宫外孕方联合甲氨蝶呤及米非司酮治疗输卵管妊娠68例,对照组用甲氨蝶呤及米非司酮治疗,治疗组在治疗成功率、血β-HCG下降情况、转阴时间、盆腔包块缩小率及平均住院日均优于对照组,差异比较均有统计学意义(P<0. 05)。王丽君[104]等发现大鼠口服紫草总酚酸720 mg?kg-1能够显著性提高米非司酮( 8.0 mg?kg-1 ) 的妊娠抑制率( P<0.05) ,并增加实验组平均死胎数,对雌二醇和睾酮无明显影响,说明其抗早孕作用不是通过升高雌二醇或降低孕酮水平来实现。
四、小结
  化瘀消癥杀胚中药复方有抑制滋养细胞增殖、促进其凋亡的作用,这可能是其降低HCG、缩小异位妊娠包块治疗异位妊娠的机制之一。化瘀消癥杀胚中药复方对宫内妊娠滋养细胞的促凋亡作用和凋亡形态学方面与输卵管妊娠滋养细胞无明显差异。
第三节 化瘀消癥杀胚中药复方对输卵管妊娠滋养细胞及宫内妊娠滋养细胞凋亡相关蛋白的影响
一、材料与设备
(一)材料
1. 主要试剂
兔抗人Bax抗体,美国Cell Signaling Technilogy公司, #5023, Lot: 2
Fasl,美国Cell Signaling Technology公司,批号:#4273, Lot: 2
兔抗人Caspase-3抗体,美国Cell Signaling Technology公司,#9665, Lot: 3
兔抗人Caspase-8抗体,美国Cell Signaling Technology公司,#4790,Lot: 3
Caspase-9,美国Cell Signaling Technology公司,#9502, Lot: 8
配胶试剂盒,碧云天生物技术研究所 P0012
一抗稀释液,碧云天生物技术研究所 P0023
免疫染色固定液,碧云天生物技术研究所 P0098
western转膜液,碧云天生物技术研究所 P0021
一抗二抗去除液,碧云天生物技术研究所 P0025
RIPA裂解液,碧云天生物技术研究所P0013
脱脂奶粉,广州翔博生物科技有限公司,XB-BD-100
BSA蛋白浓度测定试剂盒,广州翔博生物科技有限公司
二抗:Anti-Rabbit IgG (H&L) HRP Conjugate( W4011)、Anti-Mouse IgG HRP Conjugate(W4021),promega生物技术有限公司 
三羟甲基氨基甲烷(Tris),上海生工生物工程有限公司, TB0194
甘氨酸(Glycine),Life Science Products & Services ,GB0235
十二烷基磺酸钠(SDS),Life Science Products & Services, SB0485
NC膜:Merk Millipore, 9004-70-0
RT试剂盒:TAKARA公司,Lot:AK4401
定量PCR试剂盒:TAKARA公司,Lot:AK2902
Trizol:Invitrogen公司,货号:15596-026
2. 主要实验仪器
化学发光成像分析仪,GE ImageQuant LAS 4000
PCR仪:BIO-RAD公司,IQ-5
1.5ml EP管:Axygen公司, MCT-150-C
0.2mlPCR管:Axygen公司,PCR-02-C
配胶、电泳、转膜相关器械、凝胶成像系统均为美国Bio-Rad公司
余实验试剂及仪器同前。
(二)各实验组细胞
输卵管妊娠及宫内早孕滋养细胞,具体培养方法及加药分组见第一、二节。实验分组为中药高剂量组20mg/ml、中剂量组10mg/ml、低剂量组5mg/ml,甲氨蝶呤组,中药+甲氨蝶呤组,阴性对照组,作用时间均为48小时。
二、方法
(一)Wester-Blot法检测凋亡相关蛋白
1. 蛋白提取
(1)六孔板内处理过的细胞用预冷的PBS洗3遍,最后一遍吸干液体。每孔加入100μl RIPA裂解液(含蛋白酶抑制剂,磷酸酶抑制剂),用细胞刮轻轻刮取细胞数次,显微镜下观察不到贴壁细胞为止。
(2)将含细胞的裂解液吸取到一新的EP管中,置于冰上裂解30min,期间每隔10分钟涡旋一次;裂解结束后于4℃,12000g离心15-20分钟,吸取上清到新的干净EP管中,放于-20℃保存。
2. 蛋白定量
BSA蛋白定量法测定蛋白浓度后,计算含20mg蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样品至0.5ml离心管中,加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×SDS(上样总体积一般不超过35ml,加样孔的最大限度可加40ml样品)。上样前要将样品于沸水中煮5min使蛋白变性。
3. 电转
(1)电泳:配制12%SDS聚丙烯酰胺凝胶,凝固后装入电泳仪,加入足够的电泳液,将配好的蛋白样品与预染marker加入到上样孔中开始电泳,条件:70V,30min;120V,60min。
(2)转膜(湿转):准备好NC膜(7.5X4cm)和滤纸,浸泡于电转液中;根据目的蛋白的分子量,按照marker指示位置切胶,打开转移盒并放置浅盘中,用转移缓冲液将海绵垫完全浸透后将其放在转移盒壁上,海绵上再放置一张浸湿的滤纸,按“海绵—滤纸—凝胶—NC膜—滤纸—海绵”的顺序装置好(注意不能有气泡且装置电极槽不能放反);将冰盒装入缓冲液槽,注满4℃预冷的转膜缓冲液,置于冰上,按恒流250mA转膜65min。
4. 封闭
转膜结束后,将膜取出放入洗膜盒内用western转膜液快洗2-3次,每次5min;洗完后加入5%脱脂牛奶室温封闭1h。
5. 一抗孵育
将封闭好的膜用western转膜液洗3次,每次5min,置于塑料膜内,加入1:1000稀释的一抗,用塑料封口机封闭开口,置于4℃冰箱内过夜。
6. 二抗孵育
将孵育过夜的一抗回收,用western转膜液洗膜3次,每次5min;根据一抗种属来源(兔或小鼠),稀释相应的HRP标记二抗,与膜在室温孵育1小时。
7. 发光显影
  二抗孵育后TBST洗3次,每次5min;按1:1的比例配制ECL化学发光底物2ml,将膜的正面反扣于发光液中孵育1min,取出后正面朝上置于保鲜膜内,放入化学发光成像分析仪内,自动曝光出黑色条带,保存后导出图片进行分析。
(二)QT-PCR法检测凋亡相关蛋白基因的表达
1. RNA提取
(1)药物处理后的细胞经预冷的PBS洗3次后,弃去液体,加入1ml Trizol,反复吹打使细胞脱落,吸入1.5ml EP管中,室温静置5min。
(2)加入200ul氯仿,振荡混匀15秒,室温放置10min,4℃ 12000 g离心15min。
(3)吸取上层水相(不要吸到中间层的蛋白),至另一离心管中,加入0.5ml异丙醇混匀,室温放置10min。
(4)4℃ 12000 g离心10min,弃上清,RNA沉于管底。
(5)加入1ml75%乙醇,温和振荡离心管,悬浮沉淀。
(6)4℃ 7500 g离心5min,尽量弃上清,冰上晾干10min。
(7)用适量DEPC水(约20-30ul)溶解RNA样品,定量后进行RT反应。
2. RT反应

3. 荧光定量PCR反应
(1)检测序列片段大小
(2)设计引物
内参片段: GAPDH-100bp
目的片段:  Caspase-3: 85 bp、Caspase-8: 127 bp、Caspase-9: 89 bp

(3)反应条件
  混合好后加入八连管中,于BIO-RAD 荧光定量PCR仪(IQ-5)中进行反应,程序如下:95℃变性30s→95℃变性5s;60℃变性30s(40个循环) →95℃变性15s;60℃变性30s。
反应结束后读取Ct值,用双Δ算法计算出mRNA相对表达变化。
三、结果
(一)化瘀消癥杀胚中药复方对输卵管妊娠滋养细胞Bax、Fasl、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9mRNA及其蛋白表达的影响
1. Bax、Fasl、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白的表达
首先根据Bio-Rad Quantity One软件半定量得到各目的蛋白的相对灰度值,将原始资料进行均一化处理(加药组均除以阴性对照组)以校正误差,进行方差分析,结果示:
(1)Bax蛋白:与阴性对照组相比,中药高、低剂量组、中药+甲氨蝶呤组的Bax蛋白表达增加(P<0.05);中药高剂量组、中药+甲氨蝶呤组的Bax蛋白表达较甲氨蝶呤组增加(P<0.05)。
(2) Fasl蛋白:与阴性对照组相比,中药高、中剂量组、中药+甲氨蝶呤组的Fasl蛋白表达量增加(P<0.05);中药高剂量组、中药+甲氨蝶呤组的Fasl蛋白表达量较甲氨蝶呤组增加(P<0.05)。
(3) Caspase-3蛋白:与阴性对照组、甲氨蝶呤组相比,中药高、中、低剂量组、中药+甲氨蝶呤组的Caspase-3蛋白表达量均有增加(P<0.05)。
(4) Caspase-8蛋白:与阴性对照组相比,中药高剂量组Caspase-8蛋白表达量增加(P>0.05);甲氨蝶呤组caspase-8蛋白表达与中药组、中药+甲氨蝶呤组相比无显著性差异(P>0.05)
(5)Caspase-9蛋白:与阴性对照组相比,中药高、低剂量组、中药+甲氨蝶呤组、甲氨蝶呤组Caspase-9蛋白表达量增加(P<0.05);甲氨蝶呤组Caspase-9蛋白表达量较中药中剂量组增加(P<0.05),与中药高、低剂量组、中药+甲氨蝶呤组相比无显著性差异(P>0.05)。(见表24、图十-十一)

  图十、十一注:1.阴性对照组  2.甲氨蝶呤组 3.中药+甲氨蝶呤组 4. 中药低剂量组 5.中药中剂量组 6.中药高剂量组( * p<0.05;** p<0.01;*** p<0.001)
2. Bax、Fasl、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9mRNA的表达
  荧光实时定量PCR结果示:
(1)Bax mRNA:与阴性对照组相比,中药+甲氨蝶呤组的Bax mRNA值增加(P<0.05)中药高、中、低剂量组Bax mRNA与甲氨蝶呤组相比无显著差异(P>0.05)。
(2)Fasl mRNA:与阴性对照组相比,中药高剂量组、中药+甲氨蝶呤组的Fasl mRNA值增加(P<0.05);甲氨蝶呤组Fasl mRNA值较中药高剂量组、中药+甲氨蝶呤组降低(P<0.05),与中药中、低剂量组相比无显著性差异(P>0.05)。
(3)Caspase-3 mRNA:与阴性对照组相比,中药高剂量组、中药+甲氨蝶呤组的Caspase-3 mRNA值增加(P<0.05);甲氨蝶呤组Caspase-3 mRNA值较中药高剂量组降低(P<0.05),与中药中、低剂量组、中药+甲氨蝶呤组相比无显著性差异(P>0.05)。
(4)Caspase-8 mRNA:与阴性对照组相比,中药高、中、低剂量组、中药+甲氨蝶呤组Caspase-8 mRNA值增加(P<0.05);甲氨蝶呤组Caspase-8 mRNA值较中药高剂量组降低(P<0.05),与中药中、低剂量组、中药+甲氨蝶呤组相比无显著性差异(P>0.05)。
(5)Caspase-9 mRNA:与阴性对照组相比,中药高剂量组的Caspase-9蛋白表达量增加(P<0.05);甲氨蝶呤组Caspase-9蛋白表达量与中药高、中、低剂量组、中药+甲氨蝶呤组相比无显著性差异(P>0.05)。(见表25、图十二):

(二)化瘀消癥杀胚中药复方对宫内妊娠滋养细胞Bax、Fasl、Caspase-3、Caspase-8、    Caspase-9mRNA及其蛋白表达的影响
1. Bax、Fasl、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白的表达
(1)Bax蛋白:与阴性对照组、甲氨蝶呤组、中药+甲氨蝶呤组相比,中药高、中剂量组Bax蛋白表达增加(P<0.05)。
(2)Fasl蛋白:与阴性对照组相比,中药高剂量组、甲氨蝶呤组、中药+甲氨蝶呤组、甲氨蝶呤组的Fasl蛋白表达量增加(P<0.05);甲氨蝶呤组Fasl蛋白表达量较中药低剂量组增加(P<0.05),与中药高、中剂量组、中药+甲氨蝶呤组相比无显著性差异(P>0.05)。
(3)Caspase-3蛋白:与阴性对照组相比,中药高、中、低剂量组、中药+甲氨蝶呤组、甲氨蝶呤组的Caspase-3蛋白表达量均有增加(P<0.05);甲氨蝶呤组Caspase-3蛋白表达量较中药高剂量组低(P<0.05),与中药中、低剂量组、中药+甲氨蝶呤组相比无显著性差异(P>0.05)。
(4)Caspase-8蛋白:与阴性对照组相比,中药高、中、低剂量组、中药+甲氨蝶呤组、甲氨蝶呤组的Caspase-8蛋白表达量均有增加(P<0.05);甲氨蝶呤组Caspase-8蛋白表达量较中药高、低剂量组增加(P<0.05),与中药中剂量组、中药+甲氨蝶呤组相比无显著性差异(P>0.05)。
(5)Caspase-9蛋白:与阴性对照组相比,中药高、中剂量组、中药+甲氨蝶呤组、甲氨蝶呤组的Caspase-9蛋白表达量增加(P<0.05);甲氨蝶呤组Caspase-9蛋白表达量较中药低剂量组增加(P<0.05),与中药高、低剂量组、中药+甲氨蝶呤组相比无显著性差异(P>0.05)。(见表26,见图十三-十四):

 

  图十四-十五注:1.阴性对照组  2.甲氨蝶呤组 3.中药+甲氨蝶呤组 4. 中药低剂量组 5.中药中剂量组 6.中药高剂量组( * p<0.05;** p<0.01;*** p<0.001)
2. Bax、Fasl、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA的表达
  荧光实时定量PCR结果显示:
(1)Bax mRNA:与阴性对照组相比,中药高、中、低剂量组、中药+甲氨蝶呤组Bax mRNA值增加(P<0.05);中药高、中剂量组、中药+甲氨蝶呤组Bax mRNA值较甲氨蝶呤组增高(P<0.05)。
(2)Fasl mRNA:与阴性对照组相比,中药高剂量组、中药+甲氨蝶呤组、甲氨蝶呤组的Fasl mRNA值增加(P<0.05);甲氨蝶呤组Fasl mRNA值与中药高、中、低剂量组、中药+甲氨蝶呤相比无显著性差异(P>0.05)。
(3)Caspase-3 mRNA:与阴性对照组相比,中药高、低剂量组的Caspase-3 mRNA值增加(P<0.05);甲氨蝶呤组Caspase-3 mRNA值较中药高剂量组降低(P<0.05),与中药中、低剂量组、中药+甲氨蝶呤组相比无显著性差异(P>0.05)。
(4) Caspase-8 mRNA:与阴性对照组相比,中药高剂量组、中药+甲氨蝶呤组Caspase-8 mRNA值增加(P<0.05);甲氨蝶呤组Caspase-8 mRNA值较中药高剂量组、中药+甲氨蝶呤组降低(P<0.05),与中药中、低剂量组相比无显著性差异(P>0.05)。
(5)Caspase-9 mRNA:与阴性对照组相比,中药高剂量组、中药+甲氨蝶呤组的Caspase-9蛋白表达量增加(P<0.05);甲氨蝶呤组Caspase-9蛋白表达量与中药高、中、低剂量组、中药+甲氨蝶呤组相比无显著性差异(P>0.05)。(见表27、图十五):、

注:1.阴性对照组  2.甲氨蝶呤组 3.中药+甲氨蝶呤组 4. 中药低剂量组 5.中药中剂量组 6.中药高剂量组(* p<0.05;** p<0.01;*** p<0.001)
(三)两种细胞凋亡相关蛋白、基因比较
输卵管妊娠滋养细胞与宫内妊娠滋养细胞凋亡相关蛋白比较示:输卵管妊娠滋养细胞Bax蛋白在中药中、高剂量组的表达高于宫内妊娠滋养细胞(P<0.05),但caspase-3、caspase-8、caspase-9蛋白中分别在中药低、高剂量,中药低、中剂量、甲氨蝶呤组、中药+甲氨蝶呤组,中药低剂量、甲氨蝶呤组表达低于宫内妊娠滋养细胞(P<0.05),Fasl凋亡蛋白在两种细胞中的表达无统计学意义。
输卵管妊娠滋养细胞与宫内妊娠滋养细胞凋亡相关基因比较发现输卵管妊娠滋养细胞Bax、Fasl基因分别在中药高、中、低剂量、甲氨蝶呤组,中药+甲氨蝶呤组表达低于宫内妊娠滋养细胞(P<0.05),而caspase-3、caspase-8、caspase-9凋亡基因在两种细胞中的表达无统计学意义。
四、讨论
  细胞凋亡与输卵管妊娠疾病发展密切相关[105],是目前研究的热点。细胞个体的正常发育就需要机体细胞凋亡途径正常,细胞凋亡途径主要有三条:死亡受体信号通路(Fas/FasL)、线粒体(bcl-2/bax)信号通路及内质网信号通路。这三条通路最后都通过激活Caspase,从而引起细胞结构和保护成分的蛋白水解,进而发生细胞凋亡。此外,非Caspase依赖性细胞凋亡通路涉及到Bax诱导的细胞死亡,也涉及到其他蛋白酶,如钙蛋白酶、蛋白酶体及丝氨酸蛋白酶诱导的细胞凋亡,日益得到人们的重视。
  本实验研究运用Western Blot及qt-PCR技术检测化瘀消癥杀胚中药复方对两种滋养细胞相关细胞凋亡信号通路蛋白及基因的影响。从以上数据我们可以发现,输卵管妊娠滋养细胞中,中药组及中药+甲氨蝶呤组可使Bax、Fasl、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达增加,且中药高剂量组、中药+甲氨蝶呤组还可增加Fasl、Caspase-3的基因表达,可见caspase依赖性细胞凋亡通路可能是中药促凋亡的输卵管妊娠滋养细胞通路之一。而Caspase-8蛋白增加不明显,但基因表达明显增加,可能因Caspase-8剪切激活受到抑制,从而通过其他Caspase家族成员如Caspase-10启动Caspase级联反应。甲氨蝶呤组仅Caspase-9蛋白表达增加,提示甲氨蝶呤在输卵管妊娠滋养细胞促凋亡作用中有可能不是通过Caspas依赖性凋亡通路起作用。在宫内妊娠滋养细胞中,中药组及中药+甲氨蝶呤组可使Bax、Fasl、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白表达增加,且中药高剂量组还可增加Bax、Fasl、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9基因的表达,可见caspase依赖性细胞凋亡通路可能是中药促凋亡的宫内妊娠滋养细胞通路之一。甲氨蝶呤组Fasl、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白表达增加,Fasl的基因表达也增加,可见,甲氨蝶呤诱导宫内滋养细胞凋亡可能通过Fasl介导的死亡受体途径起作用。
  Fas/FasL、Bcl-2/Bax细胞凋亡通路是目前研究较多也较详细的凋亡通路,Fas/FasL在母胎免疫耐受方面的研究较多,Hammer[106]等研究发现母胎界面Fas/FasL的表达主要通过少量的胚胎抗原进入母体后,激活特异性的T淋巴细胞,使其表面表达大量Fas,而与胎盘接触后,滋养细胞表面FasL与T淋巴细胞上的Fas作用导致特异性的 T淋巴细胞凋亡,从而产生胎儿特异性的免疫耐受。朱劲松[107]等通过检测凋亡调控因子Fas、FasL 在复发性流产 (RSA) 患者胎盘绒毛滋养细胞以及蜕膜中的表达情况,发现RSA组患者胎盘绒毛滋养细胞 FasL 的表达以及蜕膜中 CD3 (+) T淋巴细胞Fas抗原的表达情况均低于正常妊娠组,认为RSA的发生可能与绒毛滋养细胞表面 FasL 表达减少,以及蜕膜中 Fas (+) T淋巴细胞凋亡减少有关。王瑞雪[54]发现化瘀消癥杀胚复方高、中剂量组FASL蛋白的表达明显增加(P<0.05),提出化瘀消癥杀胚中药复方诱导输卵管妊娠滋养细胞凋亡可能是通过上调细胞膜表面的FasL 蛋白的表达,当Fas/Fas系统被激活后,将凋亡信号由胞外传入胞内,在连接分子的媒介下,汇合于caspase-3, 再由caspase-3 催化诸多与凋亡形成有关的靶分子分解,最终导致细胞凋亡事件的发生。Bcl-2/Bax诱导线粒体凋亡通路在妊娠疾病中研究较广泛,实验研究发现滋养细胞在缺氧条件下促凋亡蛋白p53表达增加或Bcl表达降低,这些改变在子痈前期胎盘组织中也存在[108-109]。袁烁[53]通过检测化瘀消癥杀胚中药复方干预后的输卵管妊娠滋养细胞Bcl-2蛋白,发现其可下调凋亡抑制蛋白Bcl-2,使输卵管妊娠部位滋养细胞Bcl-2/Bax比例下降,通过线粒体凋亡信号通路诱导滋养细胞凋亡。
五、小结

  化瘀消癥杀胚中药复方作用输卵管妊娠滋养细胞及宫内妊娠滋养细胞后,均可上调Fas/FasL、Bcl-2/Bax凋亡通路相关蛋白的表达,提示化瘀消癥杀胚中药复方可能通过诱导Caspase介导的死亡受体及线粒体凋亡通路而促进滋养细胞凋亡,阐述了中医药治疗输卵管妊娠起效的可能机制,为进一步寻找治疗靶点提供了理论依据。

 

结    语

  近年来,输卵管妊娠患者发病率在逐年递增的同时还伴有年轻化趋势,如何在治疗疾病的同时最大限度的保全患者的生育能力是治疗的难点和热点。随着辅助医学的飞速发展和人们医学常识的普及,输卵管妊娠患者的早期诊断和治疗成为可能,此时中医药治疗的优势和效果日渐被临床医生所重视,无论是关于输卵管妊娠中医病因病机的探究,还是有效治疗方药的筛选应用、中医药介入干预的适应症和时间节点的把握,都涌现出了大量探索和研究的成果。然而,大部分的研究仍着眼于临床观察及医家的个人经验等,关于中药是通过哪些途径达到治疗输卵管妊娠的目的,中药具体的作用靶点及其作用机制探讨较少。
  前期课题组已经成功建立了输卵管妊娠滋养细胞及宫内妊娠滋养细胞的细胞模型基础,在前期的研究基础上,本研究进一步完善和优化了滋养细胞的培养方法,进一步研究化瘀消癥杀胚中药对输卵管妊娠滋养细胞可能的促凋亡细胞通路,并同时设立了宫内妊娠滋养细胞组,对比了两种细胞在生长特性,凋亡形态学及诱导凋亡细胞通路方面的异同,丰富了化瘀消癥杀胚中药的作用机理,为进一步寻找治疗靶点提供了理论依据。
一、创新点
(一)临床研究:中西医结合治疗异位妊娠效果优于单纯西药治疗已得到大多数医家的认同。本临床研究系统客观的对比了中药+MTX与中药+米非司酮对输卵管妊娠的临床疗效和优势,为临床选择用药提供依据。
(二)首次将输卵管妊娠滋养细胞及宫内早孕滋养细胞同时作为化瘀消癥杀胚中药复方干预的对象,更深入细致的探索中药复方在两种滋养细胞凋亡形态学及诱导凋亡细胞通路方面的异同。
(三)从蛋白和基因的水平探索了化瘀消癥杀胚中药复方诱导两种滋养细胞凋亡可能的细胞凋亡通路,揭示了中药治疗输卵管妊娠可能的分子机制。
二、结论
(一)中西医结合治疗输卵管妊娠疗效确切,中药+MTX在缩小包块方面疗效优于中药+米非司酮组,在HCG值下降、阴道流血、腹痛消失等方面疗效相当。
(二)输卵管妊娠和宫内妊娠滋养细胞在形态和增殖能力上并无显著的差异,其生长特性相似。
(三)化瘀消癥杀胚中药复方有抑制输卵管妊娠滋养细胞增殖、促进其凋亡的作用,这可能是其降低HCG、缩小异位妊娠包块治疗异位妊娠的机制之一。化瘀消癥杀胚中药对宫内妊娠滋养细胞的促凋亡作用和凋亡形态学方面与输卵管妊娠滋养细胞无明显差异。
(四)化瘀消癥杀胚中药复方作用输卵管妊娠滋养细胞及宫内妊娠滋养细胞后,均可上调Fas/FasL、Bcl-2/Bax凋亡通路相关蛋白的表达,提示化瘀消癥杀胚中药复方可能通过诱导Caspase介导的死亡受体及线粒体凋亡通路而促进滋养细胞凋亡。
三、不足与展望
(一)不足之处
1. 临床研究仅纳入了中药+MTX和中药+米非司酮组,如能在大样本的研究下纳入中药组、MTX组、米非司酮组五组同时做对比,结论更完善,说服力更强。
2. 虽然输卵管妊娠滋养细胞和宫内妊娠滋养细胞在形态和增殖方面无明显异常,但两种滋养细胞功能方面未做对比。
3. 本研究虽然初步确定中药复方可能通过诱导Caspase介导的死亡受体及线粒体凋亡通路而促进滋养细胞凋亡,但死亡受体和线粒体凋亡途径在凋亡通路网里属于比较下游的通路,比如P53基因、凋亡蛋白酶激活因子(Apaf-1基因)、细胞移植因子Survivin等均有可能通过激活死亡受体或线粒体途径而达到促凋亡的目的,由于时间的关系,未能寻找中药复方促凋亡的上游调控基因。
(二)展望
1. 随着异位妊娠及不孕不育发病率的增高,目前大量实验研究需要滋养细胞作为体外模型,虽然滋养细胞体外培养技术已经较成熟,但其原代培养较复杂,生长周期较慢,如果在后续实验的基础上能建立永生化滋养细胞株,则能快速的进行相关病理、药理机制的研究,省时省力。
2. 输卵管妊娠滋养细胞和宫内妊娠滋养细胞在培养中发现其形态和增殖方面无明显差异,但因其是在不同环境下生长,功能和蛋白表达可能会有差异,我们应从两种细胞功能形态方面对其生理特性进行全面对比,评估其异同。
3. 细胞凋亡通路错综复杂,寻找中药作用的上游基因如大海捞针,工作量较大。如能运用蛋白组学技术筛选出中药作用后可能的作用靶点,再进一步验证,或能揭开化瘀消癥杀胚中药复方作用输卵管妊娠的作用靶点,为新药开发奠定基础,提供理论依据。

 

参考文献 略

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