化瘀消癥杀胚中药复方对输卵管妊娠滋养细胞影响的实验研究

作者:王瑞雪|邓高丕
2015-4-23 阅读

中文摘要

目的:

  比较输卵管妊娠滋养细胞和宫内早期妊娠滋养细胞生物学特性的异同;探讨化瘀消癥杀胚中药复方对输卵管妊娠滋养细胞侵袭、凋亡及ER、PR表达水平的影响,研究输卵管妊娠的微环境调控机制及化瘀消癥杀胚中药复方作用效应的分子作用机制。
方法:
(1)两种滋养细胞的体外培养:按照纳入标准选择早期输卵管妊娠患者的输卵管妊娠绒毛组织及宫内早期妊娠人工流产绒毛组织,差异贴壁法分离培养原代滋养细胞,对其行免疫细胞化学鉴定、传代扩增至实验需要的细胞量;
(2)采用CCK-8法绘制两种滋养细胞(宫内/宫外)的生长曲线;
(3)采用扫描电镜观察输卵管妊娠与正常宫内早孕滋养细胞表面形态的异同;采用透射电镜观察化瘀消癥杀胚中药复方作用前后输卵管妊娠滋养细胞内部微观形态结构的变化;
(4)制备化瘀消癥杀胚中药复方水提醇沉液,与输卵管妊娠滋养细胞共培养48小时后,①采  用Transwell小室方法观察化瘀消癥杀胚中药复方对输卵管妊娠滋养细胞侵袭能力的影响;②采用蛋白质印迹法(Western Blot)观察化瘀消癥杀胚中药复方对输卵管妊娠滋养细胞凋亡相关蛋白Fasl和caspase-3的表达的影响;③采用实时荧光定量(Real-time)PCR法观察化瘀消癥杀胚中药复方对输卵管妊娠滋养细胞ER m-RNA和PR m-RNA表达水平的影响。
结果:
(1)成功培养了输卵管妊娠滋养细胞及正常宫内早孕滋养细胞,免疫细胞化学鉴定结果显示细胞胞浆中有CK-18 、cerb-2阳性信号,未见波形蛋白信号。
(2)两种滋养细胞生长曲线:正常宫内早孕、输卵管妊娠滋养细胞生长周期大致相同:无论是正常宫内早孕还是输卵管妊娠滋养细胞,5×103个/mL、1×104个/mL、5×104个/mL这三个浓度梯度的滋养细胞分别在第5d、第3d、第1d开始进入指数增长期,三者在接种后的第7d均达到平台期;接种浓度为1×103个/mL的细胞在第7d才开始出现增长的趋势。
(3)扫描电镜比较清晰地观察到两种滋养细胞表面丰富的微绒毛样结构,二者外观形态无明显差异,二者均有细胞融合的现象。透射电镜观察到化瘀消癥杀胚中药复方作用前的输卵管妊娠滋养细胞胞膜表面光滑、完整,可见微绒毛,胞质密度高,无空泡,核内染色质分布均匀、核仁大较完整,居中或边移;细胞器亚微结构清晰、完整;经化瘀消癥杀胚中药复方(5mg/mL)作用后输卵管妊娠滋养细胞细胞体积皱縮变小,细胞表面微绒毛减少,核膜消失,核质萎缩、碎裂,个别形成凋亡小体;部分染色质固缩,沿核膜形成数个团块状边集,核仁裂解;细胞器外渗、肿胀,空泡状明显增多;内质网扩张呈泡状,与质膜融合,或见细胞骨架解体倾向。
(4)正常宫内早孕滋养细胞和输卵管妊娠滋养细胞侵袭能力的比较:两种滋养细胞的穿膜个数差异无统计学意义(P=0.348),即可以认为两种细胞的侵袭能力无差别。
(5)化瘀消癥杀胚中药复方对输卵管妊娠滋养细胞侵袭能力的影响:高、中、低不同剂量中药复方和输卵管妊娠滋养细胞共同作用48h后,不同剂量的中药复方均可明显降低滋养细胞的穿膜个数,各加药组与对照组比较均有统计学意义(P<0.05);与阳性对照组比较:1)中药2.5mg/mL组和甲氨蝶呤组比较,差异有统计学意义(P<0.05,甲氨蝶呤优于中药2.5mg/mL组);2)中药5mg/mL 组和甲氨蝶呤组比较,差异无统计学意义(P>0.05);3)中药10mg/mL 组和甲氨蝶呤组比较,差异有统计学意义(P<0.05,中药10mg/mL 组优于甲氨蝶呤组)。
(6)化瘀消癥杀胚中药复方对输卵管妊娠滋养细胞凋亡的影响:高、中、低不同剂量中药复方和输卵管妊娠滋养细胞共同作用48h后,就FASL来说,化瘀消癥杀胚中药复方高、中、低剂量组、甲氨蝶呤组与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05),即无论是中药复方还是甲氨蝶呤均能显著增加FASL的表达;与西药组相比,化瘀消癥杀胚复方高、中剂量组增加FASL表达的水平相比西药组(甲氨蝶呤)差异无统计学意义(P>0.05),而化瘀消癥杀胚复方低剂量组FASL的表达水平明显低于甲氨蝶呤组(P<0.05);就Caspase -3来说,其蛋白相对含量在各组的表达和FASL是一致的。
(7)化瘀消癥杀胚中药复方对输卵管妊娠滋养细胞ER、PR m-RNA表达水平的影响:1)就ER来看,化瘀消癥杀胚中药复方高、中、低不同剂量组、甲氨蝶呤组与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05),即无论是中药复方还是甲氨蝶呤均能显著降低ER的表达,且随着剂量的增高,其作用明显增强,呈剂量依赖的趋势;但与阳性对照组比较,化瘀消癥杀胚中药复方高、中、低剂量组降低ER表达的水平均不及甲氨蝶呤组(P<0.05);2)就PR来看,化瘀消癥杀胚中药复方高、中、低不同剂量组、甲氨蝶呤组与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05),即无论是中药复方还是甲氨蝶呤均能显著降低PR的表达,且随着剂量的增高,其作用明显增强,呈剂量依赖的趋势;与阳性对照组比较,化瘀消癥杀胚中药复方中、低剂量组降低PR表达的水平均不及甲氨蝶呤组(P<0.05),而化瘀消癥杀胚中药复方高剂量组降低PR表达的水平和甲氨蝶呤组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。
结论:
1. 本研究成功地建立了正常宫内早孕滋养细胞和输卵管妊娠滋养细胞体外培养模型,为后续实验提供了足够数量和质量的研究载体;
2. 体外培养的输卵管妊娠与正常宫内早孕滋养细胞的生长周期大致相同;扫描电镜下二者外观形态无明显差异;二者侵袭能力亦无明显差异;
3. 化瘀消癥杀胚中药复方可显著降低输卵管妊娠滋养细胞的侵袭能力,高剂量中药组甚至优于阳性对照组的效果,推断化瘀消癥杀胚中药复方降低输卵管妊娠滋养细胞的侵袭能力可能是避免其进一步浸润妊娠输卵管的机制之一;
4. 化瘀消癥杀胚中药复方可显著增加输卵管妊娠滋养细胞凋亡相关蛋白Fasl和caspase-3的表达,这为本课题前期研究成果“化瘀消癥杀胚中药复方可诱导滋养细胞凋亡”的理论提供了又一确切证据;化瘀消癥杀胚中药复方可能通过启动Fas/FasL 系统凋亡通路最终完成了凋亡事件而在宏观上表现出“杀胚”效应;
5. 化瘀消癥杀胚中药复方能显著降低输卵管妊娠滋养细胞ER、PRm-RNA的表达,表明化瘀消癥杀胚中药复方能从性激素受体水平拮抗雌、孕激素,导致异位妊娠绒毛组织变性坏死,可能是它发挥消癥、杀胚功能的作用机理之一。

关键词:输卵管妊娠;化瘀消癥杀胚中药复方;实验研究;侵袭;凋亡

引    言

  凡受精卵于子宫体腔以外部位着床发育称为异位妊娠,其中,输卵管妊娠占异位妊娠总数的95%左右,腹腔妊娠占1%-2%,卵巢妊娠占0.2%-1%,宫颈妊娠占0.2%左右[1]。输卵管妊娠发生破裂或流产是妇科最常见的急腹症之一。近些年来,随着盆腔炎性疾病、人工流产等患者数量的逐年增多,异位妊娠发病率也有所增长,据初步统计,目前国内异位妊娠与足月妊娠之比大约为1:100。
  中医认为异位妊娠的发病与少腹宿有瘀滞,冲任、胞脉、胞络不畅,或先天肾气不足、后天脾气受损等有关,由于脾肾气虚或瘀阻胞脉、胞络,导致孕卵不能正常移至胞宫而滞留在输卵管内着床发育。大量学者通过流行病学研究证实异位妊娠的发病与盆腔炎性疾病、宫内节育器、剖宫产、人工流产、盆腔手术史、辅助生育技术的应用等多种因素密切相关。关于异位妊娠的中西医临床诊疗方面的研究,文献报道亦很丰富。其中,导师课题组通过对输卵管妊娠患者进行深入详细的回顾性分析和前瞻性研究,初步确定了输卵管妊娠中西医结合诊疗方案,根据辨证论治量化标准选择符合中医药治疗的输卵管妊娠患者,其中药治疗成功率达88.9%以上,这为本课题研究提供了规范的诊疗平台和化瘀消癥杀胚中药复方临床有效性的基础。
  目前对输卵管妊娠的研究大多着眼于病因、诊断、临床病例分析以及如何治疗的临床总结等方面,对于其发生机理的基础研究甚少,国内外关于输卵管妊娠也缺乏有效的动物模型。输卵管妊娠是胚泡的异常位置种植,类似于子宫内膜的“种植窗”,输卵管亦具有适宜于胚泡着床的结构,它同样可触发正常的母体免疫反应和激素活化,因而考虑从正常宫腔内早期妊娠为切入点来研究输卵管妊娠的发病机理,也许可以有所启示。
  本研究建立在导师课题组前期研究理论假说的基础上,认为早期异位妊娠是多种发病机制共同作用的结果,在不同的发病部位、不同个体、同一个体不同时期的发病机制可能不同,但“滋养细胞-侵袭微环境”是共同的关键窗口,是异位妊娠发生的“种子”和“土壤”的关系,化瘀消癥杀胚中药复方可能通过影响滋养细胞侵袭微环境来干预滋养细胞向周围组织的侵袭治疗早期异位妊娠。这个“微环境”不仅包括母体方面如种植部位局部的细胞外基质、妊娠相关免疫因子等构成的网络,同样可能与胚胎滋养细胞本身固有的功能所形成的“微环境”,如滋养细胞的侵袭能力、凋亡能力、分泌能力等有着密切的关系。输卵管妊娠滋养细胞和宫内早期妊娠滋养细胞是否有着同样的功能?分别种植在子宫腔和输卵管的滋养细胞生长速度有无快慢之分?电镜下细胞超微结构有无差异?化瘀消癥杀胚中药复方对输卵管妊娠滋养细胞的侵袭、凋亡、分泌等能力究竟有着怎样的影响?
  为了探索并回答这些问题,在本研究中,首先体外培养了输卵管妊娠与正常宫内早孕的滋养细胞,以细胞模型为研究对象,然后采用CCK-8绘制细胞生长曲线、Transwell小室、蛋白质印迹法(Western Blot)、实时荧光定量(Real-time)PCR法等不同研究方法,旨在比较输卵管妊娠滋养细胞和宫内早期妊娠滋养细胞生物学特性的异同,探讨化瘀消癥杀胚中药复方对输卵管妊娠滋养细胞侵袭、凋亡以及ER、PR表达水平的影响,希冀进一步认识输卵管妊娠的微环境调控机制及化瘀消癥杀胚中药复方作用效应的分子作用机制。

第一部分  文献研究

第一节  异位妊娠发病概况与病因
一、异位妊娠发病率
  异位妊娠是受精卵在子宫体腔以外部位着床发育,习称宫外孕,其中又以输卵管妊娠最为常见,输卵管妊娠流产或破裂是妇科临床上最常见的急腹症之一[1]。近些年来,异位妊娠发病率逐年上升,20余年间英国上升了4倍,美国上升了6倍; 20 世纪70年代中期,国内异位妊娠与正常分娩总数之比为1/200~1/300,80年代初达到 1/132,1993年北京报道异位妊娠与正常分娩总数之比为1/90,1995~1996年上海统计报道则高达 1/6.6[2]; 据复旦大学附属妇产科医院统计,该院异位妊娠与同期分娩数之比从1995年的1/7.38升高到2004年的1/4.12,其中输卵管妊娠占94.23%[3]。所以异位妊娠仍然为妇产科医师高度重视并需要进一步深入探索研究的疾病。
二、输卵管妊娠病因
  众所周知,自从卵子受精到受精卵着床的6天多时间内,卵细胞及以后的胚细胞在输卵管中发育、移行,若输卵管因自身病变或受邻近部位病变的干扰、阻碍,均可致使孕卵运送障碍而形成输卵管妊娠。其常见原因如下:
(一)感染因素
  若阴道菌群微生态平衡被破坏,优势致病菌种异常繁殖并沿黏膜面上行, 可通过血管、 淋巴管或周围组织直接扩散到达输卵管及盆腔内组织,导致输卵管急性或慢性炎性病变,慢性输卵管炎可致管腔皱褶粘连、管腔部分阻塞、纤毛定向摆动紊乱、输卵管管内纤毛细胞与黏膜分离等;另外,阑尾炎、盆腔结核、腹膜炎均可导致输卵管周围粘连、扭曲、僵直及伞端闭塞,导致输卵管腔狭窄、部分阻塞或蠕动异常。黄小燕对420例异位妊娠病例进行回顾性研究,结果显示这些异位妊娠中具有盆腔感染史者占25.47%[4]。
  近年来,由沙眼衣原体和淋病双球菌引起的性传播疾病(STD)被证实是和异位妊娠的发病密切相关的[5],在美国,衣原体感染率从1987年的78.5 /10万,增至2004年的485 /10 万[6],有学者认为衣原体上行感染后期形成瘢痕性输卵管后遗症,是造成输卵管妊娠的原因之一。陶丹丹等应用液体培养+固体培养和聚合酶链反应技术检测50例输卵管妊娠和对照组的患者,最终结论认为解脲脲原体和沙眼衣原体感染与输卵管妊娠的发生有关[7]。挪威的一项调查结果也显示,衣原体感染患者患异位妊娠的可能性增加1倍[8]。而流产、产后一般的细菌感染可通过淋巴和血液传播,导致输卵管周围组织炎。
(二)盆腔和腹腔手术史
  多种盆、腹腔手术均可改变输卵管的解剖和生理结构而致孕卵游走异常形成输卵管妊娠。除了常见的如剖宫产手术、阑尾切除术、卵巢囊肿切除术等,输卵管、盆腔脏器分离粘连术、输卵管再通术及子宫输卵管造影术、输卵管伞端造口术后重新粘连或瘢痕狭窄、输卵管绝育术后瘘管形成或再通、 结扎过松、结扎不牢以及技术错误等均可延迟甚至阻止受精卵进入宫腔,从而着床在输卵管形成输卵管妊娠[9]。
(三)自身或外源性内分泌激素失调
  正常输卵管粘膜细胞的纤毛活动和平滑肌活动均依赖于雌激素和孕激素的适当刺激, 当这两种激素的比例稍微改变就可导致输卵管运动和输送功能的失调,影响受精卵在输卵管中的输送[10];大剂量雌激素事后避孕失败者,其输卵管节律收缩过强, 黏膜分泌多,约10%发生输卵管妊娠[9];黄体功能不全时子宫内膜发育不良,孕酮水平低,输卵管推动力低,电生理活动明显减弱,不利卵子转送,卵细胞停滞而致异位妊娠。适量的雌激素可以加速卵子在输卵管的运行,但大剂量的雌激素则使卵子滞留在输卵管壶腹部和峡部交界处,因此,宫内接触己烯雌酚也是输卵管妊娠的可能病因之一。1977年Milnidaky等首次提出异位妊娠时血清孕酮水平较低,推测输卵管妊娠孕妇在合成孕酮中存在某种代谢阻滞作用,引发妊娠黄体合成衰退。
(四)宫内节育器 (IUD)
  国内对近2万名使用宫内节育器妇女进行的流行病学调查表明,使用IUD并不增加输卵管妊娠的发生率,但若IUD避孕失败而受孕时,则发生输卵管妊娠的机会较大。
  庄留琪等对上海市802例异位妊娠患者进行了回顾性研究,调查宫内节育器使用情况并测定其患异位妊娠的相对危险度, 结果显示, 总体上宫内节育器不会增加异位妊娠的危险, 但由于宫内节育器并不能抑制排卵,卵子仍可在输卵管内受精,而宫内节育器的作用仅局限于子宫腔内,难以影响到输卵管, 因此使用IUD能阻止绝大多数子宫内妊娠, 却难以防止异位妊娠[11]。
(五)胚胎异常和受精卵游走
  正常情况下,为保障宫内妊娠的成功建立,着床前的胚胎可产生和释放一些特定的生物活性物质以促进胚胎和子宫内膜之间的互相识别,若这些活性物质表达异常,传递了错误信号, 则可能诱发胚胎错误识别而种植于输卵管上皮;或卵子在一侧输卵管受精,经宫腔进入对侧输卵管后种植;或卵子游走于腹腔内,被对侧输卵管拣拾而种植在对侧输卵管,最终均可导致输卵管妊娠[1]。
(六)辅助生育技术
  异位妊娠是辅助生育技术(ART)助孕的常见并发症之一,使用辅助生育技术后异位妊娠发生率约为1%-5%,是自然周期中EP发生率的2倍。美国的一项调查数据显示,接受辅助生殖技术后妊娠妇女出现异位妊娠的比率是2.1%[12],其原因除了可能与患者的基础疾病有关,与移植胚胎的技术因素、移入胚胎数量与质量的关系、移植液过多、冷冻胚胎移植、输卵管肌肉舒缩功能改变等都有关系。另外,采用ART后宫内外同时妊娠发生率也会明显增加。肖红梅等研究认为,接受体外受精(invitro fertilization and embryo transfer,IVF)、单精子卵胞浆内注射( intracytop lasmic sperm injection,ICSI)、 冻融胚胎移植 ( frozen-thawing embryo transfer,FET)这三种不同的助孕方法后,IVF组异位妊娠发生率显著高于 ICSI和FET组,且患者本身有输卵管病变史是发生异位妊娠的主要原因[13]。

第二节  异位妊娠病因病机和中医药治疗研究

一、古中医文献关于异位妊娠的描述

(一)病名记载:中医古籍文献中并无异位妊娠的病名记载,按其临床表现,可散见于“停经腹痛”、“妊娠腹痛”、“经漏”、“妊娠下血”、“少腹瘀血”、“崩漏”、“癥瘕”等病名中。
(二)临床症状方面:如“妊娠心腹疼痛,忽痛如刀割”,“妊娠心腹疼痛,手足抽掣,面目青冷,出汗如雨,气欲绝”。《金匮要略?妇人妊娠病脉证并治第二十》曰 “妇人有漏下者、有半产后因续下血都不绝者、有妊娠下血者、假令妊娠腹中痛,为胞阻”;唐容川云:“瘀血在经络脏腑之间,结为癥瘕”。以上中医古籍的描述均和异位妊娠的临床症状非常类似。
(三)病因病机方面:《陈素阉妇科补解》曰:“妊娠少腹痛者,因胞络宿有风冷,却受妊之后则血不通,冷与血相搏,故令少腹痛也。” 《医宗金鉴?妇科心法要决释》说:“若冲任二经虚损,则胎不成实。” 《妇人良方》记载有“妇人月经痞塞……,血瘀在内,…瘀久不消。” 《妇科经纶》转述前人曰:“妇女行经遇冷则血流而成癥……女人恒有或不在子宫则行经受胎……如癥块阻挡子宫则行经受孕不得其正。” 《妇人良方校注补遗》云:“若母有宿疾、子脏为风冷所乘、气血失度,使胎不安,故令下血也。” 《景岳全书》曰:“瘀阻留滞作癥,惟妇人有之。其证或由经期或由产后,凡内伤生冷、或外受风寒、或恚怒伤肝气逆而血留、或忧思伤脾气虚而血滞、或积劳积弱气弱而不行。”清代段玉裁的《段氏说文解字》注:“血积于中之病也”。以上各医家的论述都与现在所说的异位妊娠发病机理相似,为后世对异位妊娠的认识和治疗奠定了坚实基础。
(四)治疗方面:《素问?阴阳应象大论》云:“血实宜决之”,提出了瘀血证治疗大法。宋代《圣济总录?妇人血积气痛》记载用没药丸“治妇人血气血积,坚僻血瘀、发竭攻刺疼痛、呕逆噎塞、迷闷及血蛊胀满、经水不行”;明代《普济方》“月水不行 腹为癥块”的条目中应用桂枝桃仁汤“治气郁乘血,经候顿然不行,脐腹酸痛、上攻心肋欲死。”

二、现代中医对异位妊娠病因病机的阐述

  现代中医学认为,输卵管妊娠的发病机理为先天肾气不足、后天脾气受损,脾肾气虚无力把孕卵运送至子宫,或少腹瘀滞,冲任、胞脉胞络不畅,运送孕卵受阻;孕卵在输卵管内发育,久之胀破脉络,阴血溢于少腹,发生血瘀、血虚、厥脱等一系列的证候,其本质是少腹血瘀证[14]。在此基础上,有人做出了从宫外孕的病因、临床表现及发展结局看, 均是以血瘀为病理核心的进一步解释。首先它是孕卵着床于不具备孕胎功能之处, 并发育为血肉之物,是为病理产物, 当属瘀证;其次, 本病临床上以下腹剧痛、 绞痛、刺痛、 疼痛拒按为特征,正如《妇人大全良方》所言“大凡腹中作痛, 畏手按者, 此内有瘀血”;另外,其结局是破裂、出血、气血随腹腔内出血而脱,而血瘀是导致出血的重要病理。因此,宫外孕的病机是血瘀少腹证[15]。

三、化瘀消癥杀胚中药复方的药味组成及功能主治
  丹参(Salvia miltiorrhiza  bunge)为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根茎。首载于《神农本草经》,为2010年中国药典(第一部)收录。苦,微寒,归心、肝经。其功能活血祛瘀,通经止痛,清心除烦,凉血消痈。用于胸痹心痛,脘腹胁痛,癥瘕积聚,热痹疼痛,心烦不眠,月经不调,痛经经闭,疮疡肿痛。《本经》称丹参“破癥除瘕”。《本草汇言》言丹参“补血生血,功过归地,调血敛血,力堪芍药,逐瘀生新,性倍川芎。妇人诸病,不论胎前产后皆可常用”。《本草纲目》称“唯一味丹参能破宿血,补新血,安生胎,落死胎,崩中带下,调经脉。”
  赤芍(Red Peony Root)为毛莨科植物芍药Paeonia lacti,lora Pall或川赤芍Paeonia veitchii Lynch的干燥根。白芍、赤芍在《神农本草经》中统称芍药。梁代《本草经集注》首次提出芍药有赤白之别,赤芍为2010年中国药典(第一部)收录。苦,微寒,归肝经。其功能清热凉血,散瘀止痛。用于热入营血,温毒发斑,吐血衄血,目赤肿痛,肝郁胁痛,经闭痛经,癥瘕腹痛,跌扑损伤,痈肿疮疡。《本草经疏》曰“妇人经行属足厥阴肝经,赤芍入肝行血,故主经闭”“主破散”。《本草汇言》称赤芍可以治疗“妇人癥瘕腹痛”。
  桃仁(Persicae Semen)为蔷薇科植物桃Prunus persica(L)Batsch或山桃Prunus davidiana (Carr)Franch的干燥成熟种子。《神农本草经》将其列为下品,载其“主瘀血血闭、症瘕邪气,杀小虫”。桃仁是妇科活血化瘀经典名方桂枝茯苓丸、桃核承气汤的重要配伍中药,为2010年中国药典(第一部)收录。苦、甘,平,归心、肝、大肠经。其功能活血祛瘀,润肠通便,止咳平喘。用于经闭痛经,癥瘕痞块,肺痈肠痈,跌扑损伤,肠燥便秘,咳嗽气喘。《本经》称桃仁“主瘀血,血闭,瘕”。《本经逢源》说桃仁“苦以泄滞血,甘以生新血,毕竟破血之功居多”。《别录》言“破癥瘕,通月水,止痛”。
  天花粉(Trichosanthin)为葫芦科植物栝楼Trichosan.thes kirilozvii Maxim.或双边栝楼Trich,osanthes rosthornii Harms的干燥根。甘、微苦,微寒,归肺、胃经。其功能清热泻火,生津止渴,消肿排脓。用于热病烦渴,肺热燥咳,内热消渴,疮疡肿毒。《别录》称其“通月水,止小便利”,而其余本草很少有此一说。宋朝王怀隐所编《太平圣惠方》中最早提到天花粉可用来堕胎,《本草纲目》则明确肯定了天花粉“通月水”和治疗“胎衣不下”的功效。《卫生易简方》用天花粉治疗胎死不下病。
  紫草(Arnebia root)为紫草科植物新疆紫草Arnebia euchroma (Royle)Johnst或内蒙紫草Arnebia guttata Bunge的干燥根,为2010年中国药典(第一部)收录。甘、咸,寒,归心、肝经。其功能清热凉血,活血解毒,透疹消斑。用于血热毒盛,斑疹紫黑,麻疹不透,疮疡,湿疹,水火烫伤。
四、各组成药味的现代药效学研究
  丹参的有效组分主要分为脂溶性和水溶性两类。脂溶性成分包括多种菲醌类物质,如丹参酮I、丹参酮IIA、隐丹参酮等;水溶性成分多为多聚酚酸类成分,主要有原儿茶醛、丹参素、咖啡酸、丹酚酸B 等[16]。现代药理学研究表明[17],丹参具有抗凝、促纤溶;扩血管;改善微循环;钙通道阻滞剂作用;清除自由基、保护线粒体;抗菌作用;抗感染作用;调节免疫功能;抑制胶原纤维的产生和促进纤维蛋白的降解,调节组织修复与再生、抗肿瘤等药理作用。沈云婕等研究发现丹参多酚酸盐对人肺腺癌细胞株SPC-A-1细胞等多种肿瘤细胞增殖都具有明显的抑制作用,而且呈现时间、剂量的依赖性;丹参多酚酸盐还可诱导SMMC-7721细胞阻滞于S期继而引起细胞凋亡[18]。
  赤芍的药效成分主要是芍药苷为主的单萜及其苷类成分、没食子酸及它的衍生物等。药理作用研究证明[19,20]其具有抑制血小板和红细胞聚集、抗凝和抗血栓、改善降低全血黏度、抗动脉粥样硬化、抗炎、抗氧化、保护心脏和肝脏、抗肿瘤等作用。Lee 等用赤芍水提物处理肝癌细胞HepG2后,发现在HepG2细胞凋亡的早期,相关基因BNIP3表达上调,而ZK1、RAD23B、HSPD1等基因表达下调,这加速了HepG2细胞的凋亡[21]。
  桃仁主要化学成分有脂质(如中性脂、糖脂质、磷脂)、苷类(苦杏仁苷、野樱苷)、糖类(葡萄糖、蔗糖等)、蛋白质、氨基酸、苦杏仁酶、尿囊素酶等[22]  桃仁具有扩张血管、抗血栓、抗凝血、预防心肌梗死和肝纤维化、提高免疫力、抗肿瘤、抗炎、抗氧化、改善血液流变性作用、改善微循环障碍、镇痛止咳、通便等广泛的药理作用[23]。
  天花粉是从我国传统中药葫芦科植物栝楼的块根中提取的,天花粉结晶蛋白是一种核糖体失活蛋白,它能够直接、专一、迅速作用于胎盘合体滋养细胞,促进核糖体失活,抑制胞内蛋白质合成,导致滋养层变性坏死,细胞解体并坏死,其碎片阻塞血窦,造成血循环障碍、胚胎组织死亡,从而达到终止妊娠的目的。钱俏采用天花粉结晶蛋白及甲氨蝶呤治疗412 例异位妊娠患者, 将研究对象随机分为A、B 两组,A组234例采用天花粉肌注,B组178 例采用MTX肌注,结果A组治愈率为95.30%,B组治愈率为70.79%, A组疗效明显优于B组,差异有统计学意义[24];汪晓菁应用肌注天花粉蛋白的方法治疗138例异位妊娠未破裂患者, 结果治愈率达90.58%,病理切片观察到输卵管妊娠部位滋养细胞不同程度的溶解、坏死、绒毛水肿和出血等改变[25]。杨晨等选用天花粉蛋白注射液肌注治疗异位妊娠共105 例, 治愈率也达90%[26]。
紫草为紫草科多年生草本植物新疆紫草的根,又称软紫草,具有凉血、活血、解毒之功,并有润燥滑肠之效。紫草的抗生育作用也很早就被发现,美国印第安人妇女很早就将紫草提取物作为避孕药广泛使用。紫草含多种萘醌类化合物、紫草素及其衍生物。它能够降低血清黄体生成素和促卵泡激素水平、抑制排卵甚至导致不孕,它也可以降低血清HCG水平,抑制黄体发育,阻碍破坏绒毛生长,人们常常利用其以上特性来辅助终止妊娠。王丽君等发现大鼠口服紫草总酚酸后可增加实验组平均死胎数,能够显著提高米非司酮的妊娠抑制率,差异有显著统计学意义,提示紫草总酚酸对绒毛功能有一定的影响[27]。紫草素能够有效的诱导绒癌裸鼠移植肿瘤细胞凋亡和坏死,明显抑制绒毛膜促性腺激素分泌,下调Bcl-2蛋白的表达[28]。
五、化瘀消癥杀胚中药复方作用机理研究
  中药复方是一个非常庞大复杂的化学成分复方,其效应物质呈现出多样性、差异性及组织性、整体涌现性等一系列的特征,方剂内部组成部分之间的相互关系、相互作用,方剂与人体之间的动态非线性相互关系和相互作用亦同样复杂,值得我们进一步研究。在临床上,以宫外孕Ⅰ号方加紫草、天花粉组成的化瘀消癥杀胚中药复方治疗早期异位妊娠显示出较好的疗效。其内在机理究竟是怎样的呢?山西医学院中西医结合宫外孕研究组通过一系列的研究,初步证明了宫外孕II号方剂化解消融宫外孕包块的机理之一,是为下列几方面的综合作用[29]:(1)宫外孕II号方可扩张血管、改善血行,从而有利于瘀血及包块的吸收;(2)宫外孕II号方促进单核吞噬细胞(尤其是巨噬细胞)吞噬消化包块;(3)宫外孕II号方可使纤溶活性升高,促进运送纤溶物质分解包块,从而更有利于巨噬细胞的吞噬作用。最近研究证明,活血化瘀药物含有丰富的具有抗血小板凝集和抗血栓等作用的芳香酸类成分,它们对整方效应的贡献不仅在于其本身的生物效应,还通过与醇形成酯化物、与碱成盐、助溶其它活血化瘀成分等不同方式改善或增强整方活血化瘀的效应[30]。
六、中医药干预异位妊娠临床策略与突破
  自山西医学院第一附属医院率先使用宫外孕Ⅰ、Ⅱ号方保守治疗异位妊娠,并取得了突破性进展后,文献报道在宫外孕Ⅰ号、Ⅱ号方基础上临证加减的方法得到了广泛应用。郭丽春将本病分为早、中、晚三期,方药组成:丹参15g、赤芍、桃仁各12g、三棱、莪术各9g、花粉30-50g。初期重用花粉50g并加蜈蚣6g活血杀胚,同时配合西药甲氨蝶呤单次肌注;中期加益母草15-20g,白花蛇舌草20g,泽泻、败酱草各15g 祛瘀利湿;后期加穿山甲10g、川芎、红花各6g消瘀通络,共治疗46例,其中治愈 25例,好转9例,有效5例,总有效率为 85%[31]。许爽君等运用宫外孕II号方加味,方药组成:赤芍15g、丹参20g、桃仁、三棱、莪术、当归、川芎各10g、天花粉30g,蜈蚣2-3 条,治疗异位妊娠共51例,其中治愈43例,无效8例,治愈率84.31%[32]。刘佳报道予自拟宫外孕汤治疗48例宫外孕患者,结果治愈45例,无效3例,治愈率93.8%[33]。郭李燕等[34]报道内服宫外孕方, 组方:丹参、赤芍各15g、桃仁、水蛭各10g、三棱、莪术各6g,天花粉、紫草根各30g, 蜈蚣3条, 皂角刺20g,每日1剂随证加减,配合紫草油纱外敷下腹部,总有效率为 67.11%,未见明显不良反应。李开琼以中药为主治疗异位妊娠,对于破损期异位妊娠且腹腔内血液未凝成血肿包块者口服宫外孕1号方剂(丹参15g,赤芍15g,桃仁9g),对未破损期异位妊娠或破损期异位妊娠已凝成血肿包块者口服宫外孕2号方(丹参15g,赤芍15g,桃仁9g,三棱、莪术各3-6g),治疗结果:单纯用宫外孕1号、2号方治愈86例(95.6%),破损期与未破损期异位妊娠的总疗效无明显统计学差异[35]。
  导师邓高丕教授率领的课题组,以中医妇科基本理论为指导思想,在长期临床实践中,创新并确立了输卵管妊娠的中医辨证分型方案,将早期输卵管妊娠归纳为未破损期的胎瘀阻滞、胎元阻络型与已破损期的正虚血瘀、气血亏脱和瘀结成癥型等五个中医证型,归纳总结出5个输卵管妊娠的主要病情影响因子,初步建立了输卵管妊娠的病情评分模型和输卵管妊娠辨病分期与辨证论治规律,并依据此中医辨证分型方案和病情评分模型确立了输卵管妊娠的中西医结合治疗方案。自从2004年起,课题组应用输卵管妊娠辨病分期、辨证论治规律及中西医结合治疗方案,临床治疗了1000余例输卵管妊娠患者,其中药物治疗成功率达到88.9%以上[36]。
  宋阳在邓高丕教授指导下采用前瞻性研究设计方案,在前期718例回顾性研究所拟定的辨病辨证规律的基础上,对输卵管妊娠患者进行前瞻性的辨病分期、辨证分型、计算病情影响因子总积分,然后分组治疗,观察了各组及各证型的治疗效果,通过分析疗效和拟定的辨病辨证规律的关系,得出结论:临床应用输卵管妊娠辨病分期辨证论治规律及论治方案治疗本病,可较准确的判断患者的病情,及时采取合理的治疗措施,其有效率达到88.9%以上[37]。邱杨在邓高丕教授指导下对输卵管妊娠发病高危因素及病情相关因子与主要中医证型(正虚血瘀型、胎元阻络型、气血亏脱型)之间的关系进行研究,目的在于寻找与输卵管妊娠发生破裂及破裂期气血亏脱危象相关的因素,研究结果表明:五个输卵管妊娠发病的高危因素(生产史、流产史、异位妊娠史、盆腔炎史及宫内节育器)在三个输卵管妊娠主要证型中的构成比具有统计学差异;四个输卵管妊娠病情相关因子在三个输卵管妊娠主要证型中的的构成比也具有统计学差异[38]。曾根在邓高丕教授指导下,在宋阳建立的早期不明位置妊娠判别方程的基础上,开发出了应用于Windows操作系统的软件,通过收集符合纳入标准的住院患者对应该方程变量的临床资料,代入早期不明位置妊娠判别方程应用软件中运算,将收集的患者资料进行归纳,运用统计学分析,通过真实性检验、可靠性检验、预测值检验,综合评估该方程的临床应用价值,最终证明早期不明位置妊娠判别方程在早期不明位置妊娠判別诊断中对于早期输卵管妊娠具有较高的检出率,有助于早期输卵管妊娠与早期先兆流产的鉴别诊断。证明该方程是一种具有较好的真实性、可靠性,相对理想的快速、非侵入性的判别方法,值得临床推广 [39]。
第三节  中药干预异位妊娠的基础实验研究进展
  孙佳琦采用电镜观察了观察组(口服宫外孕I号方后要求改为手术治疗的患者手术切除的妊娠输卵管)及对照组(直接要求手术者切除的妊娠输卵管)输卵管粘膜细胞超微形态结构的差异,并检测了输卵管妊娠绒毛组织Bcl-2的表达、妊娠输卵管粘膜ER、PR的表达。结果发现:活血化瘀消癥杀胚中药可降低输卵管妊娠绒毛Bcl-2的表达,促进输卵管妊娠胚胎死亡;可升高妊娠输卵管粘膜孕激素受体表达水平,降低输卵管粘膜对妊娠胚胎的容受性;对妊娠输卵管粘膜细胞超微结构也有显著影响,提示活血化瘀消癥杀胚中药可能影响妊娠输卵管粘膜细胞的生理代谢而影响胚胎的营养供应,不利于胚胎的存活[40]。
  袁烁以化瘀消癥杀胚复方高、中、低剂量组含药血清体外培养人输卵管妊娠滋养细胞,采用流式细胞法检测滋养细胞凋亡率,蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达,最终成功地建立了输卵管妊娠滋养细胞体外培养模型,显示化瘀消癥杀胚中药复方能明显提高输卵管妊娠滋养细胞凋亡率,并通过下调Bcl-2的表达,使Bcl-2/Bax比例下降,认为化瘀消癥杀胚中药复方诱导滋养细胞凋亡的发生可能是其发挥杀胚效应的机制之一[41]。
  刘玲采用高效液相-质谱(HPLC-MS)联用分析方法,检测质控灌服化瘀消癥杀胚中药复方后的SD大鼠血清及空白大鼠血清,用含有化瘀消癥杀胚中药成分组群的大鼠含药血清培养输卵管妊娠滋养细胞,测定化瘀消癥杀胚中复方对输卵管妊娠滋养细胞ER、PR、MMPs表达的影响。结果表明,HPLC-MS方法检测证实大鼠含药血清中含有上述化瘀消癥杀胚中药成分,可能是化瘀消癥杀胚中药复方治疗异位妊娠的药效基础;化瘀消癥杀胚中药复方可降低输卵管妊娠滋养细胞雌、孕激素受体的表达水平,说明其可能从受体水平拮抗雌、孕激素;可上调输卵管妊娠滋养细胞MMPs的表达,导致蜕膜组织变性坏死。以上共同说明了化瘀消癥杀胚中药复方治疗异位妊娠的可能机制[42]。
第四节  人绒毛组织滋养层细胞体外培养方法研究进展

一、妊娠滋养细胞概述及分类

  妊娠滋养细胞由胚胎胚外层细胞逐步演化而来。滋养层最初只有一层扁平立方形细胞组成,当绒毛形成以后,这层细胞逐渐分化为两层:其外层的合体滋养细胞 (syncytiotrophoblast,ST)和子宫蜕膜直接接触,内层的细胞滋养细胞(cytotrophoblast,CT)和间质直接接触。
  按照形态和功能来分,细胞滋养细胞(cytotrophoblast,CT )和合体滋养细胞(syncytiotrophoblast,ST)[43]各自具有不同的形态,各自执行不同的细胞功能。细胞滋养细胞是一种卵圆形或多角形、均匀的上皮细胞,胞界清晰,核分裂呈活跃相,呈单个、圆形核、细胞质较少、或透明或颗粒状。细胞滋养细胞为滋养干细胞,具有很强的增殖分化的能力,随着妊娠的进展,它有两种分化形式:位于绒毛表面的细胞滋养细胞直接分化为合体滋养细胞;位于绒毛外与胎盘床连接处的锚定绒毛部位的细胞滋养细胞则分化为中间型滋养细胞(intermediate trophoblast,IT)。合体滋养细胞则由胞质丰富、多核、嗜酸性或双染性的细胞组成,缺乏核分裂现象。合体滋养细胞是已经分化成熟的细胞,它能合成分泌多种妊娠相关激素,从而在胎儿与母体的物质交换中起到重要的作用。
  按照所在位置来分,位于绒毛表面的滋养细胞称为绒毛滋养细胞(villous cytotrophoblasts,VCT),VCT的有丝分裂活跃,它可分化成新滋养细胞;新的滋养细胞膜消失、融合成为绒毛外层的合体滋养细胞;而位于其他部位的滋养细胞称为绒毛外滋养细胞(extravillous cytotrophoblasts,EVCT)。EVCT具有侵袭能力,可侵犯子宫内膜、肌层以及螺旋动脉,并将螺旋动脉改建成为低阻、 高容量血管,以便维持足够的母体血液流入绒毛间支持胎盘的功能。总之,绒毛滋养层主要由细胞滋养细胞和合体滋养细胞组成,而绒毛外滋养层主要由中间型滋养细胞组成 [43]。
  人绒毛滋养细胞的体外分离培养,是研究相关妊娠疾病的基础,可为探索妊娠相关疾病的发病机制及原理提供有用的实验工具,然而,如何才能获得足够数量、纯度较高的滋养层细胞,怎样才能获得和体内滋养层细胞结构、功能高度一致的体外培养的滋养细胞,仍是目前研究的方向,利用体外培养滋养细胞进行细胞因子、受体、激素等方面的研究也在妇产科科研领域迅猛发展,并且取得了不少重要的成果。
  输卵管妊娠部位的绒毛滋养层细胞,同样具备具有内分泌功能的合体滋养细胞和具有侵袭活性的绒毛外滋养细胞[44,45]。罗善云[46]等研究发现输卵管妊娠部位滋养层细胞发育较差,两层滋养层细胞不明显,其中轴的结缔组织成分较少,且分布稀疏。我们参照早期宫内妊娠绒毛滋养细胞培养方法,在体外培养输卵管妊娠绒毛滋养层细胞,试图为研究输卵管妊娠滋养细胞的生物学特性及揭示输卵管妊娠发病机制提供有效细胞模型。
二、人绒毛滋养细胞原代培养、分离纯化及鉴定方法
(一)原代培养方法
  目前国内外报道的滋养层细胞的原代培养主要有组织贴块法和酶消化法两种。
1. 组织贴块方法培养滋养细胞  将绒毛糊状组织碎片直接贴于培养瓶上,加培养液进行培养。其优点是操作步骤较少、污染几率低,成功率高。缺点为原代细胞生长周期较长,因而不能在短时间内获得大量所需的细胞,另外,在体外培养过程中无法保证滋养细胞功能状态,也容易混杂由间质细胞分化来的成纤维细胞。王雪萍[47]实验发现将人绒毛滋养层细胞用组织块法行原代培养,胰蛋白酶消化法行传代培养,免疫组织化学染色细胞鉴定示细胞纯度达95%以上;李幼飞[48]应用联合酶消化和组织块法的改良培养法:先用酶消化使组织块更加细小,缩短酶消化时间从而减少酶消化对滋养层细胞的损伤,然后将经消化酶作用后的残余组织吹散后直接接种,原代细胞生长周期明显短于其他两种方法,细胞接种后5、6d即可以传代,细胞纯度可达90%。
2. 酶消化法培养滋养细胞 在组织碎片中加入适量的消化酶之后,将其离心、取沉淀,用培养液配制成一定浓度,并平铺于培养瓶里面进行培养。常用的消化酶主要是胰酶,另外有胶原酶、DNA 酶等,根据所需滋养层细胞的产量和纯度的不同要求,不同实验采用不同酶的浓度、种类、作用时间。酶消化法的优点在于原代细胞产量高,所获得细胞纯度相对组织块法高。 其缺点在于:(1)酶消化法要经过反复消化离心,实验步骤较繁琐,亦容易导致污染;如FTANK[84]等实验研究报道,细胞的消化和离心过程均会造成不同程度的损伤,甚至导致形成大量无核、单核的合体滋养细胞碎片,体外培养的滋养层细胞的功能和结构也会因此而受到影响;(2)胰蛋白酶消化作用的非特异性可能导致原代培养的滋养层细胞纯化前含有大量其他杂质细胞;(3)胰酶试剂的质量参差不齐,消化条件很难统一。因此,酶消化法的关键在于控制酶的浓度、作用时间、酶处理温度在分离细胞中的作用,目前比较常用的胰酶浓度为0.25%,37℃,消化时间为30分钟。刘涛采用低浓度胰蛋白酶消化方法(0.125%胰蛋白酶液)和改良的复合酶消化梯度离心法(复合酶含0.125%胰酶、4.2 mM MgSO4、25 mM Hepes及20 U /Ml DNase I),进行人早孕绒毛外细胞滋养细胞原代分离培养对比研究,发现改良的复合酶消化梯度离心法所得细胞总量、绒毛外细胞滋养细胞纯度及数量均显著高于低浓度胰蛋白酶消化方法[49]。张小红认为采用改进的胰酶消化法分离培养人早期妊娠绒毛滋养层细胞,加0.0625%胰酶,37℃消化25~40 分钟;以差速贴壁法和消化排除法纯化细胞可简单、快捷地获得较高纯度的早孕绒毛滋养层细胞[50]。
(二)分离纯化方法
  妊娠早期绒毛组织包括滋养层细胞、内皮细胞、成纤维细胞、霍夫曼细胞以及血细胞等成分[51]。不同分离纯化方法所获得的滋养层细胞纯度大概为40%~90%。绒毛滋养细胞的纯化和鉴定,是原代培养滋养层细胞质量控制的关键环节。目前国内外采用的方法有: BSA梯度、免疫磁珠纯化、免疫亲和层析、Percoll 密度梯度离心、淋巴细胞分离液分离、流式细胞仪分选法、系统差别消化法等。
  由于BSA密度梯度法所需要的限制性培养液配制步骤比较复杂,加入细胞培养液中的成分对滋养层细胞的结构和功能影响与否还需要根据后续研究目的来决定,并非固定的,因此很难统一限制性培养液的成分,目前应用很少。免疫亲和层析法和免疫磁珠纯化法虽然可以分离出很高纯度的原代滋养细胞,但是二者对抗体的制备要求均很高, 而且经层析柱吸附后的滋养层细胞在结构和功能上会有一些变化,亦难以推广应用。国内有学者将Percoll连续密度梯度简化成两层密度梯度对滋养层细胞进行分离,取到较好效果。如白菡等调整了Percoll的浓度,选择密度为1.040g/l的30%浓度Percoll细胞分离液和密度为1.080g/l的60%浓度Percoll细胞分离液,分离和纯化滋养层细胞,结果在这两个梯度之间形成了很好的细胞带,鉴定结果滋养细胞占94%以上,而经淋巴细胞分离液获得的滋养层细胞中混杂较多的成纤维细胞,滋养层细胞仅占70%左右[52]。张久聪[53]亦将分离梯度简化为 2层:35%(密度值为1.043 g/l)与45%(密度值为1.062g/l),使所要分离的滋养层细胞处于2层之间,经台盼蓝排斥试验计算,本方法分离活细胞率为80%-90%。淋巴细胞分离液分离法是用密度为1.078g/mL 的淋巴细胞分离液( Ficoll) 代替 Percoll 密度梯度液,将滋养层细胞离心并聚集在两层淋巴细胞分离液之间,由于淋巴细胞分离液的质量不同,因此对滋养层细胞的融合可能有影响,国內外应用也较少。国内陈丽娟应用早孕绒毛膜滋养层细胞细胞膜分子 HLA- G均一性的高表达、在同一时空的绒毛组织结构区域的其他细胞不会表达 HLA- G分子的原理,在经过酶消化的细胞混合液中加入小鼠抗人抗体(PE标记),使用流式细胞仪对HLA- G阳性表达的细胞进行分选,最终得到的滋养层细胞纯度可达98.0%,其不足之处是anti-HLA-G 抗体的较高价格可能使得这种分离纯化方法的应用受到限制[54]。系统差别消化法的原理是:血细胞和间质细胞属非贴壁细胞,而滋养细胞和成纤维细胞属贴壁细胞,在换液时即可弃去上述两种非贴壁细胞。剩下的成纤维细胞贴壁速度比滋养细胞快,且对胰酶更敏感,血清可促进成纤维细胞增生和上皮样细胞贴壁[55]。张小红利用差异贴壁法、消化排除法以及反复换液法纯化人早孕绒毛滋养层细胞,在培养的起初1小时采用无血清的培养基,以抑制成纤维细胞快速增殖及滋养层细胞贴壁,传代培养时观察到细胞脱落即终止消化并弃掉消化液,进一步去除成纤维细胞,研究者认为这种方法可简单、快捷地获得高纯度的人早孕绒毛滋养层细胞[50]。
(三)细胞鉴定方法
  目前,文献报道的关于细胞鉴定指标并没有统一规范的标准鉴定系统,研究者常常从细胞形态结构、细胞骨架、细胞功能等几个方面对其评价和鉴定。
细胞形态:
  一般情况下,体外培养的上皮细胞呈扁平多角形或片状铺展生长;成纤维细胞镜下呈梭形、交织网格状。张小红在光学显微镜下观察原代培养滋养细胞,镜下细胞呈三角型或多边形或梭形,细胞核较大、卵圆形,呈紫蓝色,胞浆粉红色,部分细胞多核,细胞平铺状生长,部分交织形成网状[50]。王海霞在光镜下见滋养细胞24 小时即贴壁, 48-72 小时完全铺展,细胞呈略不规则的圆形、椭圆形,胞核相对较小,胞浆丰富,胞膜上丰富的微绒毛突起,充分显示绒毛滋养层细胞的特征。袁烁[41]等电镜观察可见滋养细胞成不规则多边形,胞核明显,胞质丰富,细胞表面见微绒毛;滋养细胞胞核大而明显,呈卵圆形,内质网扩张;细胞与细胞之间可见清晰的桥粒连接[56]。
  细胞骨架:包括免疫细胞化学和流式细胞仪两种检测方法。
(1)免疫细胞化学方法
  免疫细胞化学法原理是先用抗滋养层细胞特异性分子标志的抗体与细胞结合,再用酶标二抗识别、显色,根据细胞阳性率,来确定滋养细胞的纯度。对于滋养层细胞鉴定目前应用较为广泛的方法是采用抗细胞角蛋白抗体和抗细胞波形蛋白抗体。细胞角蛋白(CK)是细胞骨架特有蛋白,在CK家族中CK-7 在滋养层细胞上表达特异性最强,常常用于滋养细胞的鉴别,Genbacev报道认为在分离制备的滋养细胞较纯的情况下,其阳性率可达95%以上[57]。Frank等研究证明,在人胎盘基质细胞中有多种细胞角蛋白的表达,但CK-7是滋养层细胞最特异的骨架蛋白,所以他建议CK-7阳性率少于50%的滋养细胞均不可用于实验研究[58]。波形纤维蛋白( vimentin) 在子宫基质细胞、成纤维细胞等间质细胞中呈阳性表达,在滋养细胞中则表达阴性。  综上,结合细胞角蛋白CK-7 阳性,波形纤维蛋白阴性即可以将滋养层细胞和间质细胞区分开来。cerbB-2是某些侵袭性肿瘤细胞的标志蛋白,EVCT在绒毛组织中是唯一具有侵袭性的上皮型细胞,因此可特异性表达cerbB- 2[59],而VCT则不表达cerbB- 2,故该分子可作为区分EVCT与VCT的特异性标志。但国内对此研究较少。刘涛用低浓度胰蛋白酶消化方法和改良的复合酶消化梯度离心法两种不同方法培养滋养细胞,鉴定均见表达cerbB- 2信号的EVT[60]。
(2)流式细胞仪可同时检测多个参数,它是目前最客观、最有效地确定滋养细胞活性、纯度及多样性的一种方法,但由于成本较高,若所选抗体特异性不高,也会出现假阳性的结果。
  细胞功能:主要包括滋养细胞可分泌β-hCG和hPL。一般绒毛滋养细胞4小时开始分泌β- hCG,培养2~4 天β- hCG水平达峰,7天后维持低水平。体外培养的单核滋养细胞分泌胎盘生乳素48小时达峰,72小时后下降,多核滋养细胞分泌的胎盘生乳素水平则较低。
第五节   滋养细胞侵袭与凋亡生物学特性的研究
一、关于滋养细胞侵袭特性的研究
  宫内早期妊娠时,胚胎的植入过程首先需要滋养层细胞对子宫基质的粘附和侵入。绒毛外滋养层细胞具有类似肿瘤细胞的浸润特性,胚泡滋养层细胞与子宫内膜细胞相接触,然后启动粘附、迁移、基质降解、侵蚀母体血管及新生血管生成、侵袭子宫内膜等一系列信号级联反应,因此由滋养层构成的胚泡壁对子宫内膜宿主的侵入行为是植入过程的主动、主要事件[62]。然而,与肿瘤细胞浸润的不同之处在于:滋养细胞的侵袭行为受母体及自身旁分泌、自分泌因子的多环节严格调控。它具有严格的时空限制,侵袭部位仅限于子宫内膜乃至肌层内三分之一,且仅发生于妊娠早期。若滋养细胞的侵袭调节紊乱,如侵入不足会造成自然流产或胎儿宫内发育迟缓、先兆子痫或妊高征等,而过度侵入则可能导致葡萄胎甚至绒癌 [63]。
(一)影响滋养细胞侵袭的因素及信号转导通路
  滋养细胞侵袭行为受多种因素的影响。粘附分子、蛋白酶类和细胞因子均可影响滋养细胞侵袭能力。趋化因子是细胞因子中最大的家族,迄今为止已发现人类的趋化因子有近50种,Ishii认为[64]在母胎界面滋养细胞或蜕膜淋巴细胞分泌的趋化因子与滋养细胞膜上相应受体结合后,以自分泌或旁分泌的方式调节胎盘形成分化及行使功能,这与滋养细胞侵袭行为密切相关。Hamilton 等[65]认为人孕早期绒毛外滋养层细胞来源的 IGF2 ê 和蜕膜来源的 IGFBP21 以自分泌或旁分泌方式促进滋养层细胞的迁移,从而促进滋养层细胞的侵入。整合素是细胞外基质在细胞膜表面的一种公共受体,是一类新的细胞黏附分子,它主要介导细胞和细胞外基质之间的黏附[66],在滋养层细胞分化过程中,细胞膜表面的整合素可发生一定的变化从而促进滋养层细胞浸润[62]。陈慧[67]等采用逆转录多聚酶链反应( RT-PCR) 方法,探讨外源性肿瘤坏死因子( TNF-α) 及其多克隆抗体对原代滋养细胞侵袭力的影响,认为外源性细胞因子TNF-α可以增强滋养细胞的侵袭力,多克隆抗体 anti TNF-α则降低其侵袭力。杨蕾[68]实验证明瘦素、FN、MMP9能增强CTB的侵袭能力,且瘦素与FN有协同作用。与滋养细胞侵袭力相关的主要有局部粘附激酶(FAK)、小分子G蛋白、磷酸肌醇3激酶(PI3K)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、JAK/STAT信号转导通路和Smad家族的信号蛋白等6个主要信号传导通路[69]。
(二)研究滋养细胞侵袭常用模型
  细胞外基质( extracellular matrix,ECM ) 的主要成分包括层黏连蛋白、纤粘连蛋白、胶原、体外黏连蛋白、硫酸肝素、透明质酸、弹性纤维等。人工重构的Matrigel 是目前使用广泛的用来检测滋养细胞或肿瘤细胞侵袭能力的ECM[70]。Matrigel是从小鼠 EHS肿瘤提取的细胞外基质组分,它与人机体内的细胞外基质成分相似,目前使用较多的塑料侵袭小室有 transwell和minicell。张曦倩[71]等为探讨滋养层细胞侵袭调节机制,建立了绒毛外细胞滋养层细胞(EVCT)体外侵袭模型,EVCT在Matrigel 培养不同时间后,用CCK-8 评价细胞生长状况发现其生长指数未有明显变化,提示Matrigel 对EVCT 的生长未见明显影响;EVCT 在Transwell 侵袭系统中培养不同时间后,根据侵袭细胞的OD值提示48小时后细胞侵袭作用达到平台期。本模型为研究妊娠生理、妊娠病理、妊娠免疫耐受及正常细胞到肿瘤细胞之间的转化提供了实验平台。
二、关于滋养细胞凋亡特性的研究
(一)细胞程序性死亡、细胞坏死、细胞凋亡的概念区分
  细胞程序性死亡(programmed cell death,PCD),是指细胞在一定生理或病理条件下,遵循自身的程序,通过自我调控结束自己生命的过程[72];细胞坏死(necrosis)是由于某些外界因素的影响,比如理化损伤、高、低温或营养供应的阻断以及微生物的侵袭等造成的细胞急速死亡;细胞凋亡(apoptosis,Apo)是个体发育过程中基因调控下的细胞自杀活动,是多细胞有机体为调控机体发育、维护内环境稳定、由基因编码程序的细胞主动死亡过程[73]。无论是在形态方面还是生物化学方面,细胞凋亡和细胞坏死是两种截然不同的死亡方式,然而实验证明,低浓度细胞毒药物可诱导细胞凋亡,而浓度超过一定阈值则转化为细胞坏死。既往观点认为,细胞凋亡和程序性细胞死亡是统一概念,然而近年来的研究发现,细胞凋亡既有PCD部分,又有非程序部分的存在,例如由细胞毒药物诱导的细胞凋亡过程。适度的细胞凋亡是组织、器官正常发育过程中的生理性行为,过度的细胞凋亡则会导致组织器官的器质性病变或功能障碍[74]。妊娠早期滋养细胞存在明显的凋亡现象,而且随着妊娠进展,凋亡细胞类型所占比例各有不同,其中早孕期合体滋养细胞的凋亡率较高,随着妊娠进展则逐步下降。
  I shihara等用CCK-8 评价细胞生长状况,采用透射电镜和 TUNEL法观察正常妊娠各期胎盘细胞凋亡状况,发现在正常早早孕(妊娠4~5周)时,合体滋养细胞和细胞滋养细胞的凋亡占优势,但在妊娠7周以后,凋亡细胞明显减少[75]。Kokawa等研究发现自然流产患者的绒毛及蜕膜组织中具有特征性的DNA 裂解条带,原位分析表明,在正常宫内妊娠时细胞凋亡主要发生在细胞滋养层,而在自然流产时则主要发生在合体滋养层 [76]。另一项研究报道,不明原因的复发性自然流产者滋养层细胞凋亡数量明显增多[77]
(二)滋养细胞凋亡的调节因子及作用机制
  细胞凋亡受到来自细胞内外的诸多信号的调控。细胞接受凋亡调节信号后,凋亡的执行主要有三条下游通路:一是Fas 通路,即细胞外凋亡信号(例如Fas) 与凋亡受体结合(如Fas 配体)导致Fas胞内的死亡区形成三聚体的活化形式,随后引起与之结合的FADD构象改变,启动相关蛋白酶级联反应。Fas属于TNF受体家族,其具体传导通路为:Fas与配体FasL结合后,Fas多聚化,引起接头蛋白 FADD ( Fas-associated death domain)死亡域DD聚集,然后通过死亡效应域(death effect domain,DED)与pro-Caspase-8 (原半胱氨酸天冬氨酸水解酶-8)的DED 结合,激活Caspase-8,它再启动下游的一系列级联反应导致凋亡发生。在整个妊娠过程中,合体滋养细胞和细胞滋养细胞都可以表达FasL,与蜕膜中母体淋巴细胞与滋养细胞表面的FasL结合即触发自身的凋亡[78]。Fas /FasL在植入过程中和植入后发展局部免疫耐受中起重要作用,促炎细胞因子γ-干扰素 ( IFN -γ)和肿瘤坏死因子 TNF- A可促进滋养细胞 Fas表达和提高灵敏度,然而抗炎细胞因子白介素IL- 8和 IL- 10增加滋养细胞对Fas介导的抵抗性。尽管滋养细胞表达 Fas, Fas灵敏度不一定与其表达相关,这个滋养细胞-细胞因子-Fas/FasL三联体决定了Fas /FasL调节滋养细胞生存力的能力及其所致的妊娠成功或失败。二是线粒体通路,此学说认为细胞内凋亡信号通过作用于线粒体,促使线粒体释放出细胞色素C而激活Caspase -9,然后激活下游凋亡效应分子Caspase -3而诱导细胞凋亡的发生; 三是内质网通路,该通路主要存在于鼠系细胞中,目前的研究认为人类细胞中Caspase -12 的激活诱导细胞凋亡还缺乏足够的证据支持。所有凋亡信号传导通道最终都通过激活相当保守的、组成性表达于细胞质的一系列半胱氨酸蛋白水解酶即caspase,它们是凋亡的最终完成者,能特异性地作用于其底物天冬氨酸残基,导致凋亡细胞的特征性形态学和生物学改变。
  评价细胞的凋亡有多种方法。形态学方面,如电镜下可观察到染色质的凝聚、核裂解、胞质膜的“发泡”现象,核固缩及凋亡小体的形成等;凋亡的生化特征之一表现为染色体DNA广泛断裂为大小不一的核小体片段,称为DNA梯带(DNA ladder),这种细胞凋亡的DNA降解断裂现象可用蛋白酶K法、琼脂糖凝胶电泳、原位末端标记法等方法测出;检测凋亡诱导的各种酶类,如Caspase -3 、Caspase -8等;检测凋亡相关的基因调控及蛋白表达,如p53基因、Bcl-2家族、死亡受体家族等;细胞凋亡时各种刺激因素常引起Ca2+浓度的变化,因此,检测细胞内Ca2+是研究凋亡信号传递的常用方法之一。流式细胞术应用于测定细胞凋亡不仅简单、快速,更可以精确测定凋亡细胞的百分含量[79]。
(三)宫内外妊娠滋养细胞增殖及凋亡特性的比较研究
  王长安[80]等用光镜对异位妊娠35例(全部为输卵管妊娠手术切除标本)及宫内妊娠95例标本常规病理切片进行分指标阅读统计,探索与异位妊娠及宫内妊娠有关的胎盘组织变化,发现妊娠早期输卵管滋养层细胞增生比宫内妊娠更显著,而蜕膜组织却发育不良。Rangoa [81] 等发现,与正常宫内妊娠不同,细胞凋亡在输卵管妊娠中经常发生在绒毛膜而不是在底蜕膜中。由于母体微环境不同,输卵管妊娠外周绒毛滋养层细胞的旁分泌影响因素可能缺乏,细胞凋亡的通路引导失败,导致输卵管妊娠滋养细胞凋亡数量比宫内妊娠滋养细胞凋亡数量下降。同样,Kokawa[82] 的研究证明,早期宫内妊娠的细胞凋亡在绒毛组织和蜕膜中,异位妊娠的细胞凋亡发生在绒毛膜比正常宫内妊娠明显,而异位妊娠中蜕膜细胞的凋亡则比较少见。而国内高新萍等对宫内、外妊娠滋养细胞凋亡研究结果与Kokawa恰恰相反:观察到异位妊娠及正常早孕绒毛滋养细胞及蜕膜细胞中均有凋亡现象的发生,在输卵管妊娠胚胎植入部位,绒毛滋养细胞凋亡率较宫内妊娠滋养细胞凋亡率下降,但前者的蜕膜细胞凋亡率增加,但这两种组织细胞凋亡指数无明显直线相关关系,两组绒毛滋养细胞增殖指数无明显差异[83]。另外,此实验还证明了Bc1-2和Bax蛋白在人正常早孕及异位妊娠中均参与了滋养细胞和蜕膜细胞的凋亡机制。

第二部分  实验研究

实验一  输卵管妊娠及正常宫内早孕滋养细胞的培养、分离、传代、鉴定及生长曲线的绘制
一、研究目的和内容
  人绒毛滋养细胞是一种妊娠相关的细胞,它在胚胎植入、母胎免疫耐受过程均发挥着重要作用。由于不受复杂的内环境的影响,妊娠绒毛滋养层细胞体外培养可在人为条件下对细胞进行多方面的研究,不仅为研究妊娠相关疾病的发病机制提供了重要的实验工具,同时可避开用人体实验进行研究所带来的伦理学问题,是研究各种妊娠疾病的基础。
本研究拟体外分离培养输卵管妊娠部位的绒毛滋养层细胞及正常宫内早孕绒毛滋养层细胞并利用免疫细胞化学方法进行细胞鉴定,这是后续实验——宫内、宫外妊娠滋养细胞生物学特性的对比研究以及探讨化瘀消癥杀胚中药复方对输卵管妊娠滋养细胞影响的前提与必备实验。通过绘制两种滋养细胞生长曲线,探索体外培养的宫内、外滋养细胞生长增殖规律,根据它们的生长特点选择合适细胞接种浓度,是后续实验的前提和基础。
二、临床病例标本采集
(一)研究对象
  输卵管妊娠及正常宫内早孕绒毛病例来源:
1.输卵管妊娠绒毛病例来源
  输卵管妊娠绒毛均来源于2012.5-2012.10在广州中医药大学第一附属医院妇科病房住院手术的输卵管妊娠患者的绒毛组织。
2.正常宫内早孕绒毛病例来源
  正常宫内早孕绒毛均来源于2012.5-2012.10在广州中医药大学第一附属医院妇产科门诊自愿要求人工流产的,妊娠 6-8周的健康妇女的胎盘绒毛组织,胚胎发育正常,B超证实为正常宫内妊娠。
  所有输卵管妊娠研究对象还必须严格按照下列的诊断标准、纳入标准和排除标准选择[41]。
(二)输卵管妊娠病例临床诊断标准
1.有停经史(个别无明显停经史),下腹疼痛(小部分可无下腹疼痛),或有不规则阴道流血;
2.妇科检查:子宫常大或略大,一侧附件或可触及包块,有压痛;
3.β-HCG阳性;
4.盆腔B超:宫内未见孕囊,宫旁出现液性或混合性回声区,或该区有胚芽或原始心管搏动;或宫旁回声区虽然无输卵管妊娠声像特征,但腹腔内存在无回声暗区或直肠子宫陷凹处有积液;
5. 诊断性刮宫及病检未见绒毛。
(三)输卵管妊娠病例临床纳入标准
1.符合诊断标准(1)-(4),参考诊断标准(5)。
2.患者未服用药物,直接要求手术;或因输卵管妊娠破裂、流产而行急诊手术治疗者。
3.已签署许可收集绒毛的知情同意书。
(四)输卵管妊娠病例临床排除标准
1.不符合诊断标准及纳入标准者;
2.非输卵管妊娠的异位妊娠患者;
3.术前曾经药物治疗干预过的患者。
(五)取材方法:
1.输卵管妊娠绒毛取材方法:无菌条件下取术中输卵管妊娠患者的绒毛组织,放入含有100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的4℃PBS中,快速送往实验室,在无菌超净台内用4℃PBS冲洗3次,去除血污,剪去蜕膜等其他物质,挑选漂起的绒毛枝剪下迅速于超净工作台中分离细胞。 
2.正常宫内早孕绒毛取材方法:无菌条件下取宫内早孕负压吸宫术中患者的绒毛组织,放入含有100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的4℃PBS中,快速送往实验室,在无菌超净台内用4℃PBS冲洗3次,去除血污,剪去蜕膜等其他物质,挑选漂起的绒毛枝剪下迅速于超净工作台中分离细胞。
三、材料与方法
(一)材料
1. 实验材料
细胞培养试剂:
胎牛血清:CIBCOTM,批号:8131650
DMEM/F12培养液:HyClone,批号:MXH0680
0.25%胰酶:吉诺生物 (USA),批号:20110919
青/链霉素混合液:批号:20120305
CCK-8试剂盒:日本同仁公司,批号:PC752
细胞培养板、培养瓶:CORNING公司
PBS:吉诺生物(USA)
超净水,电导平18-2(自制)
免疫组化试剂:
PBS缓冲液(pH7.2~7.4)配法:1000mL蒸馏水加氯化钠8.5g,磷酸氢二钠2.8g,磷酸二氢钠0.4g;
0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)配法:1000mL蒸馏水中加枸缘酸三钠3g,枸橼酸0.4g;
SA1021小鼠IgG免疫组化试剂盒:博士德生物技术有限公司,批号:06L31CJ;
SA1022 兔IgG免疫组化试剂盒:博士德生物技术有限公司,批号:O7J01AJ;
DAB显色试剂盒:博士德生物技术有限公司,批号:07D16B22;
Anti-C-erbB-2(BA001,批号:Y-07E26)、Cytokeratin 18(批号:BM0032)、Vimentin(批号:BM0135)抗体:博士德生物技术有限公司;
Giemsa染料:Sigma;
无水乙醇等分析纯;
移液器,眼科镊,眼科剪,无菌枪头等;
2. 使用主要仪器设备
CXSPRO型电热恒温箱(苏州江东)
317型CO2培养箱,Thermo(USA)
Sw-CJ-工F型净化工作台(苏州净化)
1.6-R型冷冻离心机,Thermo(USA)
21-R型冷冻离心机,Thermo(USA)
TD25-WS型自动平衡离心机(长沙湘仪)
E200型三目显微镜(Nikon,JP)
TS100型倒置显微镜,Nikon(JP)
DX1800型全自动化学发光免疫分析仪 (BeekmanUSA)
多功能酶标仪:瑞士TECAN Genios
纯水器:广州誉维生物技术仪器有限公司
低温冰箱:日本SANYO公司MDFU 5410
超低温冰箱:美国Thermo995
3. 培养条件
  使用DMEM/F12培养液,调整pH值为6.8-7.0,于37℃,5%CO2条件下进行培养,每日定时观察细胞生长状况,当细胞铺满培养瓶底的90%左右时,使用0.25%胰蛋白酶消化、传代。
(二)培养方法
1.滋养细胞的原代培养
(1)将输卵管妊娠绒毛组织置于PBS液中充分洗涤,共3次,仔细去除蜕膜、血污等杂质。
(2)将剩余绒毛组织剪碎至1mm3左右,共约lmL,收集至离心管中,离心10分钟后,弃上清,再向离心管中加入等体积的0.25%胰酶。
(3)将离心管置于37℃水浴振荡消化约10分钟左右。
(4)加入 2mL DMEM/F12培养液,吹打混匀,用200目筛网过滤。
(5)将细胞液轻吹打混匀后均匀铺入培养瓶中。
(6)将细胞培养瓶置于37℃二氧化碳培养箱中1小时后取出,吸出上清及漂浮组织转入离心管中。
(7)再次离心,弃上清,将剩余组织轻轻吹打混匀,均匀铺入细胞培养瓶中,再加入l0mL 的DMEM/F12培养液,置于二氧化碳培养箱中继续培养。
2.滋养细胞的分离(差异贴壁法)
(1)在贴壁生长良好的细胞培养瓶中,加入0.25%胰酶消化细胞,加入DMEM/F12完全培养液终止消化,离心、弃去上清液。
(2)将细胞液铺入到新培养瓶中,加入DMEM/F12完全培养液3mL,轻轻吹打后静置20分钟。于倒置显微镜下观察,由于成纤维细胞比上皮细胞贴壁快(成纤维细胞的贴壁时间为十分钟左右,而滋养细胞贴壁时间为l-2小时),理论上来讲,此时贴壁的细胞主要为成纤维细胞,而上皮细胞大多仍悬浮在培养液中,将细胞培养液收集于另一个培养瓶中,如此重复3次后铺瓶,置于37℃的CO2培养箱中继续培养。
(3)镜下观察可见大部分细胞伸展呈圆形,约5、6天后,细胞数量增多,呈三角形或长梭形并连接成片状。
(4)当细胞生长接近融合,铺满瓶底90%左右时,用0.25%的胰酶(含0.02% EDTA)消化液传代,部分冻存。
3.细胞的传代培养
(1)弃去培养液,加入1mL含0.25%胰酶的消化液进行消化(0.02?TA);
(2)拧紧培养瓶瓶盖,于倒置显微镜下观察,看到细胞趋近于圆形,部分悬浮后,立即加入适量的DMEM/F12完全培养液终止消化,正常宫内早孕滋养细胞消化时间一般为3min(输卵管妊娠滋养细胞消化时间为30s),轻轻吹打培养瓶中若干次以悬浮细胞,再吸出细胞悬浮液,将其转移至15mL离心管中,1000r/min,离心5分钟;
(3)弃离心管中上清液,加入DMEM/F12完全培养液重悬细胞,计数细胞数量,将细胞悬液进行分瓶,各加入适量完全培养基至细胞培养瓶中,置于5%CO2、37℃培养箱常规培养。
4、免疫细胞化学鉴定细胞纯度
(1)细胞爬片终止培养后,PBS洗3次,每次2分钟,细胞载片用4%的多聚甲醛室温固定20分钟;
(2)0.5%Triton X-100 通透1次, 20分钟,PBS清洗标本3次,每次5分钟;
(3)用3%H2O2去离子水室温孵育10分钟,以消除内源性过氧化物酶活性,PBS洗3次,每次5分钟;
(4)滴加5%BSA封闭液,室温30分钟,甩去多余液体;
(5)滴加一抗(50倍稀释的Anti-C-erbB-2抗体、Cytokeratin 18抗体和Vimentin抗体), 4℃过夜后,置于室温20分钟,37℃ 20分钟,然后PBS洗3次,每次5分钟;
(6)滴加生物素化二抗,37℃30分钟,PBS洗3次,每次5分钟;
(7)滴加链霉素化亲和素试剂,37℃30分钟,PBS洗5次,每次5分钟;
(8)DAB显色;DAB显色呈棕褐色为阳性结果;
(9)蒸馏水洗,苏木素复染1分钟,饱和磷酸氢二钠分化;
(10)脱水、透明、封片、镜下随机观察 100个细胞计算阳性率。
注:宫内早孕妊娠滋养细胞的培养、分离、传代及免疫组化鉴定方法同输卵管妊娠滋养细胞。
5. 细胞计数
  吸取10ul制备好的单细胞悬液,加至血细胞计数板与盖玻片之间,显微镜下计数血细胞计数板4个大格内的细胞数,包括左侧和上方压线细胞,随后根据公式计算:(根据实验目的调整相应细胞浓度)。
6. 细胞冻存与复苏
(1)选取生长接近融合的细胞,弃去培养上清,加入适量0.25%胰酶消化,2分钟后加入DMEM/F12完全培养基终止消化,轻轻吹打使其完全脱落并将其收集至离心管中,1000rpm离心5分钟,吸弃上清,加入适量冻存液重悬,使其终浓度约为1×107个/ml。
(2)细胞冻存遵循“慢冻”原则,将冻存管于4℃放置30min,随后将其转入至-20℃放置2h,随后转至-80℃超低温冰箱中可保存数月,最后转移至液氮罐中保存。
(3)细胞复苏遵循“速溶”原则,从-80℃超低温冰箱或液氮罐中取出冻存管,迅速投入37℃水浴中,迅速摇动使冻存液快速融化。
(4)取出冻存管,用75%酒精棉球擦拭后旋开冻存管,吸出细胞悬液至培养瓶中,随后加入适量DMEM/F12完全培养液,放入37℃,5% CO2,饱和湿度的培养箱中培养。次日,更换培养液,继续培养或者传代。
7. 绘制细胞生长曲线及确定细胞最佳接种密度
  取生长状态良好的细胞,按1×103/mL,5×103/mL,1×104/mL,5×104/mL接种于96孔板,每孔接种200μL,每个浓度设置3个复孔,CCK8法分别测定培养第0d、1d、2d、3d、4d、5d、6d的细胞活力。每天每个浓度取3个复孔,加入20μL CCK8试剂孵育4h,酶标仪测OD450,记录每日每个细胞浓度OD450值,取3个复孔的均值,以OD450值为纵坐标,时间为横坐标,绘制细胞生长曲线。
  宫内早孕妊娠滋养细胞生长曲线的绘制同输卵管妊娠滋养细胞。
四、结果
(一)两种滋养细胞形态
  倒置显微镜下观察:原代分离的滋养细胞铺入新培养瓶后,大部分细胞伸展呈圆形,1h后可见部分细胞贴壁,24h后大部分细胞贴壁及部分细胞聚集,5、6天后,滋养细胞数量显著增多,大多呈不规则多角形或梭形、纺锤形、星形,核大呈卵圆形, 位于胞质近中央, 胞浆丰富透明。细胞贴壁生长,生长状态良好,细胞透亮,折光性良好。正常早孕及输卵管妊娠滋养细胞外观上未见明显形态学差异。倒置显微镜下细胞形态见图1 

(二)免疫细胞化学鉴定滋养细胞纯度
  结果显示,体外培养的滋z养细胞表达抗CK-18阳性、抗c-erbB-2阳性,染色后胞浆染为棕色;而抗Vimentin阴性,胞浆不染色。即滋养细胞特征性地表达细胞角蛋白CK-18,不表达波形蛋白Vimentin, 按上述方法检测分离纯化的滋养细胞纯度>90%,结果见图2及表1。

 

(三)正常宫内早孕及输卵管妊娠滋养细胞生长曲线

  由图3、4可知,正常宫内早孕、输卵管妊娠滋养细胞生长周期接近,接种浓度为1×103个/mL的细胞在第7d才开始出现增长的趋势,接种浓度为5×103个/mL的细胞在第5d开始进入指数增长期,1×104个/mL的细胞接种浓度在第3d开始进入指数增长期,5×104个/mL的细胞接种浓度在第1d开始进入指数增长期,随后的第二天、第三天、第四天一直处于指数增长期。5×103个/mL、1×104个/mL、5×104个/mL的细胞在接种后的第7d均达到相同数量级,此时,细胞已经完全铺满96孔板的孔底,由于密度抑制,细胞停止生长,若再继续培养下去,由于培养液中营养物质的缺乏和代谢废物的累积,细胞增殖活力将下降。见图3-4.

五、讨论

(一)正常宫内早孕及输卵管妊娠滋养细胞的原代培养及分离、传代
  研究者认为,目前体外培养的绒毛滋养层细胞大多是细胞滋养细胞,合体滋养层细胞只占到38%[84]。滋养层细胞的原代培养主要包括组织块法和酶消化法,前者操作简便,步骤较少,不容易受外界微生物污染。其缺点在于:①原代细胞生长增殖周期长,不能在短时间内获得大量细胞;②在生长过程中无法保证滋养层细胞的功能状态,且容易混杂由间质细胞分化来的成纤维细胞。酶消化法的一般步骤是将绒毛组织块加入适量的酶消化后,离心、取沉淀,加入培养液配制成一定浓度的细胞悬液后平铺于培养瓶中培养。与组织块法相比,细胞在短时间内可生长成片,酶消化法可以在短时期内得到大量活细胞,原代细胞产量、纯度相对于组织块法均较高。然而消化酶的选择对细胞选择、分离、成活率的高低有很大影响,采用不同的胰酶消化条件可收集绒毛组织中不同类型的细胞[85],但由于消化酶消化作用强,使用时对其浓度和时间必须严格控制,否则会损害细胞膜的结构。查阅文献发现,目前滋养细胞原代培养方法的研究,大多基于以上两种方法,以及在此基础上的改良,均可收获比较满意的细胞数量及质量。本实验滋养层细胞的原代培养采用的方法为单纯胰酶消化法,在未来的研究中,应进一步借鉴并改良传统酶消化法,例如根据 DNA 酶能减少胶冻样物质形成的特点,采用胰酶/DNA 酶序贯消化法等更为优化的实验方法[86]。
  妊娠早期的绒毛组织中含有滋养层细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞、Hofbauer细胞及血细胞等不同的细胞成分[87]。不同的分离纯化方法所获得的滋养层细胞纯度为40%~90%。目前国内外采用的方法可概括为以下几种:系统差别消化法、Percoll 密度梯度离心法、BSA 梯度法、淋巴细胞分离液分离法、免疫亲和层析法、流式细胞仪分选法等。在实际应用中,以上各方法各有优劣,本研究采用的是差异贴壁法分离滋养细胞。
  在滋养细胞体外培养体系的建立过程中,细胞的接种密度、培养基组成、 酸碱度、离心的速度、消化时间的长短对滋养细胞存活均有不同程度的影响。由于输卵管妊娠绒毛标本非常珍贵,且其绒毛分支粗大稀疏,取材过程中易混杂血块、蜕膜等杂质成分,消化后细胞数量相比宫内滋养细胞较少、活力差,不容易培养;宫内早孕绒毛分支稠密,或呈密集绒絮状,消化后细胞数量多,活力佳,接种后细胞容易贴壁,生长迅速。罗善云[88]等研究结果亦表明:正常宫内早孕绒毛组织发育良好,外层为合体滋养细胞,内层为细胞滋养层细胞,其中轴的结缔组织较多,互联成网状;而输卵管妊娠滋养层细胞发育差,两层滋养层细胞不明显,其中轴的结缔组织成分较少,且分布稀疏。我们前期经过多次预实验摸索,严格控制实验条件(如根据文献报道调整滋养层细胞生长培养基的最佳pH值为6.8-7.0等),最终获得了形态单一、 生长稳定的宫内、宫外两种滋养细胞。然而,为了进一步提高滋养细胞培养的成功率和稳定性,仍有必要寻找更好的组织消化酶,以及低成本、有效地用于质量控制的分子标志。另外,作为细胞模型,还要考虑到培养过程中滋养细胞的变性和分化问题,即如何保证体外培养的滋养细胞和体内滋养层细胞结构和功能的完全一致。
(二)正常宫内早孕及输卵管妊娠滋养细胞的鉴定
  对于滋养层细胞的鉴定,目前国际上尚无统一的标准。本研究采用了显微镜下形态学和免疫细胞化学相结合的鉴定方法。
1.显微镜下形态学
  滋养细胞需要与间质细胞相鉴别,光镜下观察细胞的大体形态可粗略鉴别,通常情况下,离体培养的上皮来源细胞呈扁平多角形,呈片状铺展生长;而成纤维细胞则呈梭型,交织呈网格状[89]。根据光镜下滋养细胞与成纤维细胞不同的生长形态,基本可排除成纤维细胞。
2.免疫细胞化学
  细胞角蛋白( CK)是细胞骨架特有的蛋白,在此家族中CK -7在滋养细胞上表达的特异性最强,常用于滋养细胞鉴别;而波形纤维蛋白( vimentin)在子宫基质细胞、成纤维细胞等间质细胞中表达呈阳性, 而在滋养细胞中则是阴性的,可借此将滋养细胞与间质细胞等区分开[90]。结合细胞角蛋白 CK-7 阳性,波形纤维蛋白阴性即可对滋养层细胞鉴定;cerbB-2是某些侵袭性肿瘤细胞的标志蛋白,EVCT在绒毛组织中是唯一具有侵袭性的上皮型细胞,因此可特异性表达cerbB-2,而VCT则不表达cerbB- 2,故该分子可作为区分VCT与EVCT的特异性标志[91]。但国内对此研究较少。刘涛[92]用低浓度胰蛋白酶消化方法和改良的复合酶消化梯度离心法两种不同方法培养细胞,鉴定均见表达cerbB- 2信号的 EVT。国内刘惠萍、李珍[93-94]均报道所培养的滋养细胞中CK18 和波形蛋白 Vim共表达,表达部位在细胞质,前者推测该细胞在体外培养过程中,细胞性状发生改变,出现向间质细胞方向转化的部分性状。本实验所培养的滋养细胞,抗角蛋白CK18阳性表达,抗波形蛋白 Cy3阴性,这说明体外分离培养的细胞为滋养细胞,其中无间质细胞生长。抗C-erbB-2阳性表达,则证实了体外培养的滋养细胞含有具有侵袭功能的绒毛外滋养细胞的成分,为后续滋养细胞侵袭实验奠定了基础。
(三)CCK-8法检测体外培养的正常早孕及输卵管妊娠滋养细胞生长活力
  Mosmann建立的MTT比色法,具有简单、快速、经济、无放射污染等优点,是细胞生物学研究领域的分析细胞生长活性、增殖状态的常用方法之一[95]。但它也有其局限性:由于 MTT经活细胞线粒体脱氢酶转化生成的蓝紫色结晶物并非水溶性,吸出培养基时容易带出结晶或者细胞,对实验结果会有一定影响。Cell Counting Kit- 8简称 CCK-8试剂,利用 CCK-8试剂检测细胞活性的方法通常称为CCK-8法,它是为克服 MTT法检测细胞活性稳定性不佳、对于重复性实验结果容易出现较大差异等不足而近年来新出现的细胞活性检测方法[96],CCK-8法的检测原理与常规MTT法略有不同, 检测条件也略有差异, 试剂经活细胞线粒体脱氢酶转化后形成的水溶性结晶, 可直接比色,无需有机溶剂助溶,对细胞毒性小,实验误差亦较小。熊建文[97]利用HL60作为研究对象,对比了MTT法和CCK-8法在最佳检测时刻和检测波长等参数的差异,认为用CCK-8法检测的OD值与活细胞数的线性相关度要优于MTT法,CCK-8法是一种灵敏度较高、重复性好的的细胞活性检测方法。
  本实验即采用了目前较为先进的CCK-8法来测定滋养细胞的生长活力。
  关于妊娠滋养细胞的增殖活力,陈晓等报道,绒毛膜滋养层细胞培养24小时后可见组织块边缘有细胞迁出,于10-15天左右生长最迅速[98]。施琼等实验显示细胞消化传代后的12-48h为细胞的对数生长期,48h后即进入平台期[99]。王云研究发现,原代早孕人滋养细胞接种后第3天细胞生长开始加快,3-6天细胞增殖明显加快,至第7天后复又减慢,进入平台期[100]。
  本研究显示,在同一细胞浓度下,正常宫内早孕、输卵管妊娠滋养细胞生长周期接近。然而,无论是正常宫内早孕还是输卵管妊娠滋养细胞,不同的细胞浓度,其开始进入指数增长期的时间有所差异——大体来看,在1×103个/mL-5×104个/mL的细胞接种浓度范围内,随浓度梯度的增加,细胞进入指数生长期的所需时间缩短,且5×103个/mL、1×104个/mL、5×104个/mL这三个浓度梯度的细胞在接种后的第7d均达到相同数量级,此时细胞已经铺满96孔板的孔底,由于密度抑制,细胞基本停止生长。这部分结果和王云的研究结果较一致。可是,临床上,大家熟知输卵管妊娠滋养细胞分泌的HCG水平一般要低于同期正常宫内早孕滋养细胞分泌的HCG水平,从外观上看,输卵管妊娠绒毛组织的密度也明显较同期宫内妊娠者稀疏,但从本实验的结果看,两种体外培养的滋养细胞增殖能力却没有显著的差异,都有着相似的生长特征。

实验二   输卵管妊娠及正常宫内早孕滋养细胞形态学的扫描电镜观察

一、研究目的与内容
  制备输卵管妊娠与正常宫内早孕滋养细胞扫描电镜样品,扫描电镜下观察比较两种滋养细胞表面形态的异同。
二、材料与方法
(一)实验材料与仪器
扫描电镜:德国  LEO-1430VP型
2.5%戊二醛:上海金泓化工有限公司
1%锇酸:上海恒远生物科技有限公司
(二)方法
扫描电镜制样步骤如下:(制样对象为体外培养的输卵管妊娠滋养细胞、正常宫内早孕滋养细胞)
1.培养细胞经2.5%戊二醛固定1小时;
2.清洗: PBS,15min×3次;
3.前固定:2.5%新鲜预冷戊二醛4℃固定,2小时后送电镜室继续进行制样;
4.漂洗:PBS,15min×3次;
5.脱水: 50%、70%、90%丙酮各1次,100%丙酮3次,每次15分钟;
6.置换:加入乙酸异戊酯,2小时;
7.把培养细胞放入临界点干燥仪中干燥,干燥后取出培养细胞用导电胶把样品固定在样品台上,在真空镀膜仪中镀膜,镀好后把样品放入扫描电镜中观察并摄影。
三、结果
扫描电镜下两种滋养细胞形态  见图5

  扫描电镜均可比较清晰地观察到两种滋养细胞表面丰富的微绒毛样结构,二者外观形态无明显差异,二者均有细胞融合的现象,其相邻细胞之间发生融合时,表面微绒毛突起稍稍变短钝。结果见图5。
四.讨论
  扫描电镜是依靠样品表面放出的二次电子量的不同来形成图象反差的,能直接观察较大体积样品表面的三维立体结构,具有明显的真实感,因此扫描电镜非常适合于观察样品的表面结构,而且扫描电镜的样品制备和样品处理也非常方便[101]。扫描电镜还可用来观察细胞凋亡现象,在扫描电镜下,凋亡细胞一般显示细胞体积缩小,微绒毛减少或消失,部分细胞表面出现单个或多个泡状突起。孙耘田[102]等报道扫描电镜看到合体滋养细胞的整个细胞的表面有发育完好的微绒毛,这些微绒毛具有不同的高度,其中含有胞质及微丝,表面还可以发出许多细丝与临近的微绒毛相连络。这种微绒毛结构是合体细胞的特点。正是由于有丰富的微绒毛而使合体滋养细胞呈海绵状外观。王海燕等也利用扫描电镜比较清晰地观察到绒毛外细胞滋养层细胞(extravillous cytotrophoblast,EVCT)和绒毛细胞滋养层细胞(villous cytotrophoblast,VCT)的差别[103]:前者无微绒毛,相邻的EVCT虽然互相靠拢,但并不融合,细胞之间有明显的缝隙;后者与相邻细胞融合时,表面微绒毛突起变短钝,提示细胞融合发生在细胞表面平滑区。而与王海燕上述研究结果不同,吴霞等用扫描电镜观察到EVCT细胞表面具微绒毛,呈放射状向周围突出。相邻的滋养层细胞间有明显间隙;VCT表面亦具微绒毛,绝大多数细胞呈聚集状,但细胞间尚有间隙,部分滋养层细胞己融合成巨大的ST,扁平贴附于培养器皿表面[85]。张磊[104]等对体外连续培养 72代的滋养细胞人早孕滋养细胞株( HPT-8)进行鉴定分析,扫描电镜下可见细胞呈扁平、不规则多边形,表面有丰富的微绒毛和小泡。
  本研究用扫描电镜观察到正常宫内早孕及输卵管妊娠滋养细胞表面均具有丰富的微绒毛样结构(图5),二者外观形态并无明显差异,由于目前没有统一的扫描电镜观察标准,只是散见于研究者的文献报告,单单从“微绒毛”这一特征很难断定所观察到的滋养细胞究竟是为绒毛外细胞滋养层细胞(extravillous cytotrophoblast,EVCT)还是绒毛细胞滋养层细胞(villous cytotrophoblast,VCT)。另外,正常宫内早孕及输卵管妊娠滋养细胞在扫描电镜下均观察到细胞融合的现象,相邻细胞之间发生融合时,表面微绒毛突起稍变短钝,部分滋养层细胞融合成巨大多核的合体滋养细胞,它们融合时的具体方式、过程也各不相同,或上下覆盖,或左右平行接触,或多个细胞聚居,具体如图5所示。

实验三  化瘀消癥杀胚中药复方对输卵管妊娠滋养细胞超微结构影响的透射电镜观察

一、研究目的和内容

  制备化瘀消癥杀胚中药复方作用前后的输卵管妊娠滋养细胞透射电镜样品,镜下观察用药前后输卵管妊娠滋养细胞内部超微结构的变化。
二、材料与方法
(一) 实验材料、药物与仪器
1.实验材料
2.5%戊二醛:上海金泓化工有限公司
1%锇酸:上海恒远生物科技有限公司
2.实验用药物
(1)中药饮片均购自广州中医药大学第一附属医院门诊药房,产地、批号见表2。

(2)注射用甲氨喋呤:由广州中医药大学第一附属医院中心药房提供,山西普德药业股份有限公司,批号:02110901,规格:5mg/支。
3. 主要仪器
透射电镜             日本          HITACHI H-7500型
循环水式多用真空泵   SHZ-B型      巩义予华仪器有限责任公司
套式恒温器           TC-15        海宁新华医疗仪器厂
旋转蒸发仪           RE-52AA      巩义予华仪器有限责任公司
圆底烧瓶、冷凝管、烧杯、量筒等若干  四川蜀牛玻璃仪器公司
(二)方法
1.化瘀消癥杀胚中药复方水提醇沉液的制备方法:
(1)原生药材提取及过滤:
取化瘀消癥杀胚复方2剂,共150g,置于2000ml圆底烧瓶中,加入900ml蒸馏水,浸泡40分钟后,电热套2000oC加热(注意圆底烧瓶不可触碰加热套内壁),回流提取2次,每次1小时(微沸后),棉花过滤,合并2次滤液。
(2)水提液的制备:
将所得滤液于旋蒸仪上800C减压浓缩至75ml,得2g/ml浓缩液,留浓缩液25ml,另50ml置离心管内封装,4oC冰箱保存备用。(水提液)
(3)水提醇沉液的制备:
将离心管内50ml浓缩液加入100ml的95%乙醇,使乙醇终浓度为63%。充分振摇后放置过夜,取上清液,浓缩挥干溶剂,以蒸馏水定容至100ml,得1g/ml浓缩液,安剖瓶封装。(水提醇沉液)
(4)中药提取物的灭菌:
  将封装后的中药提取液置热压灭菌锅内灭菌,灭菌环境为131oC(0.18MPa),30分钟,灭菌完毕后, 40C冰箱保存药液备用。
2. 化瘀消癥杀胚中药复方水提醇沉液与输卵管妊娠滋养细胞共培养:
  将生长状态良好的输卵管妊娠滋养细胞以1×104个/mL接种于6孔板内,每孔1mL,37℃,5% CO2恒温培养箱中培养2天,弃原培养液,加入无血清的DMEM/F12培养液,置于37℃,5%CO2恒温培养箱中继续培养24h,使细胞生长同步化,弃去培养液,加入不同浓度的中药水提醇沉液,使其终浓度分别为2.5mg/mL、5mg/mL、10mg/mL,然后在37℃,5% CO2、饱和湿度条件下培养48h。
3.透射电镜制样方法步骤:(制样对象为未经化瘀消癥杀胚中药复方作用的输卵管妊娠滋养细胞、化瘀消癥杀胚中药复方中剂量组即:5mg/ml作用48h后输卵管妊娠滋养细胞)
(1)收集细胞:预先一天细胞换新鲜培养基,第二天将处于对数生长期的细胞约106/ml,常规消化,PBS离心漂洗(800rpm/min)2次,最后一次收集于EP管中,离心速度稍高(1200rpm/min),成肉眼可见之细胞团块;
(2)前固定:弃去缓冲液,加入2.5%新鲜预冷戊二醛4℃固定,后送电镜室继续进行制样;
(3)漂洗:0.1MPBS漂洗4次,每次15分钟;
(4)后固定:1%锇酸固定1~2小时;
(5)漂洗:双蒸水漂洗4次,每次15分钟;
(6)脱水:50%、70%、90%丙酮各1次,100%丙酮3次,每次15分钟;
(7)浸透: 丙酮∶环氧树脂=1∶1浸1小时;
(8)丙酮∶ 环氧树脂=1∶2浸2小时;
(9)纯环氧树脂浸透过夜;
(10)包埋、聚合:浸透后的标本于包埋胶囊的纯环氧树脂中,72℃,8小时;
(11)超薄切片、染色:修块后切60~90nm超薄片,200目铜网捞片,醋酸双氧铀-柠檬酸铅染色,置于透射电子显微镜下观察并摄影。
三、结果
透射电镜下输卵管妊娠滋养细胞形态 见图6

 

  输卵管妊娠滋养细胞胞膜完整、光滑、表面可见微绒毛,细胞质密度较高,核内染色质分布均匀、核仁大,基本完整,居中或者边移;核膜周围可见小空泡状的脂滴;细胞器亚微结构清晰完整,还可见到粗面内质网、高尔基体等结构。
  化瘀消癥杀胚中药复方作用于输卵管妊娠滋养细胞48h后,观察到滋养细胞体积变小、皱縮,细胞表面的微绒毛减少,核质萎缩、碎裂,个别形成凋亡小体,核膜消失;部分染色质出现固缩,沿核膜形成数个团块状边集,核仁解体;细胞器外渗、肿胀、细胞质内空泡状脂滴显著增多;内质网扩张呈泡状,与质膜融合,有些细胞可见细胞骨架解体,细胞核裂解为碎块,进而细胞质膜内陷,将细胞分隔,产生多个有膜包裹的凋亡小体。结果见图6。
四、讨论
  透射电镜样品要求比较高,观察重点在于细胞排列、连接、细胞核形态、染色质分布、细胞内部各种细胞器数量及形态变化情况等。在透射电镜下,输卵管妊娠滋养细胞微绒毛基底部附近的胞质内有许多小空泡,这是合体滋养细胞胞饮活动的证据。核膜周围见小空泡状脂滴,说明体外培养的输卵管妊娠滋养细胞具有分泌的能力;胞质内有大量的内质网及核糖体颗粒,合体细胞与细胞滋养细胞间或可看到桥粒或桥粒样结构。
  “细胞凋亡” 概念的提出最初源于对细胞形态学特征的观察[105]。随着细胞凋亡研究的进展,对于细胞形态学检测,主要有光学显微镜、透射电镜、扫描电镜和特殊的形态学染色方法等,这些检测方法各有其优势,其中,透射电镜的证据仍为目前比较公认的证明细胞是否发生凋亡的形态学依据,因为透射电镜不仅可用于观察不同凋亡时期细胞的结构变化,还可将观察信息通过荧光屏再现,使细胞精细的超微结构清晰易见,它能提供凋亡发生最确切的证据,故现仍被认为是判断细胞凋亡的金标准[106-107]。细胞凋亡是一个动态的连续过程,期间并无严格的区分点,而且凋亡过程非常快,甚至在几分钟之内发生。电镜下细胞的凋亡可分为两个阶段:第一阶段为细胞核、细胞质固缩及凋亡小体的形成;第二阶段是凋亡小体被其他细胞吞噬和降解。程勇前[108]等通过透射电镜观察分离纯化后细胞滋养层细胞,观察到三种形态:未成熟细胞滋养层、过渡型细胞滋养层细胞、成熟细胞滋养层细胞细胞,其中成熟细胞滋养层细胞体积较大,表面微绒毛发达,可见较多被膜小凹,胞质内可见较多膜包小泡及丰富的微丝,脂滴较多。培养48 h 后的细胞电镜观察可见多个核的合体滋养层细胞,细胞内可见桥粒等细胞连接结构和一些局部的细胞间隙。
  本实验用透射电镜观察到化瘀消癥杀胚中药复方作用于输卵管妊娠滋养细胞48h后细胞体积变小、皱縮,细胞表面的微绒毛减少,核质萎缩、碎裂,个别形成凋亡小体,核膜消失;部分染色质出现固缩,沿核膜形成数个团块状边集,核仁解体;细胞器外渗、肿胀、细胞质内空泡状脂滴显著增多;内质网扩张呈泡状,与质膜融合,细胞骨架解体倾向。这表明化瘀消癥杀胚中药复方诱导输卵管妊娠滋养细胞发生凋亡具有确切的形态学方面的依据。

实验四  输卵管妊娠与正常宫内早孕滋养细胞侵袭能力的比较及化瘀消癥杀胚中药复方对输卵妊娠滋养细胞侵袭能力的影响

一、研究目的与内容
  本实验应用 Matrigel 模拟细胞外基质以诱导滋养细胞通过Transwell小室的侵袭运动,希冀比较输卵管妊娠与正常宫内早孕滋养细胞侵袭能力,并评价化瘀消癥杀胚中药复方对输卵管妊娠滋养细胞侵袭能力的影响,为进一步探讨输卵管妊娠的微环境调控机制提供证据。
二、材料与方法
(一)材料
1.实验材料
胎牛血清:              CIBCOTM,批号:8131650
0.25%胰酶+0.02?TA: CIBCOTM,批号:20110919
DMEM/F12培养液:      HyClone,批号:MXH0680
Matrigel Basement Membrane Matrix:BD Bioscience
24 孔 Transwell 侵入小室和带有微孔的聚碳酸酯膜(膜直径6.5 mm,微孔直径 8μm):Corning Costar 公司
小滤器、培养瓶、培养板: Corning Costar 公司
2.主要仪器设备
二氧化碳培养箱:   日本SANYO公司   MCO175
低温冰箱:         日本SANYO公司   MDFU 5410
E200型三目显微镜: NikonJP
(二)方法
1.Matrigel的制备:在-20℃下取出分装的Matrigel,放置于4℃冰箱过夜,使其解冻,隔日在细胞超净台上以无血清的DMEM/F12培养液稀释Matrigel,至浓度为1mg/ml;
2.铺胶、包被基底膜:取出在-20℃下预冷好的24孔板,把50μl稀释好的Matrigel均匀铺于Transwell小室的底部,在37℃培养箱中放置3 小时,使Matrigel充分凝聚;
3.各组药物与滋养细胞共培养:将生长状态良好的输卵管妊娠滋养细胞以1×104个/mL接种于6孔板内,每孔1mL,37℃,5%CO2恒温培养箱中培养2天,弃原培养液,加入无血清的DMEM/F12培养液,置于37℃,5% CO2恒温培养箱中继续培养24h,使细胞生长同步化,弃去培养液,加入不同浓度的中药水提醇沉液,使其终浓度分别为2.5mg/mL、5mg/mL、10mg/mL,同时设立阳性对照组(甲氨蝶呤,按照人临床常规用量折算为终浓度1.5mg/mL)和空白对照组。然后在37℃,5% CO2、饱和湿度条件下培养48h。
4.接种细胞:将进入对数生长期的各组滋养细胞以0.25%胰酶消化、离心、弃上清液,以无血清DMEM/F12培养基重悬细胞沉淀,吹打均匀后计数细胞,调整至所需的浓度。接种1.0 x 104个滋养细胞于Matrigel包被的Transwell小室中,小室内的培养基为无血清的DMEM/F12,体积是200μl,然后于小室外(即24孔板的孔内)加入500μl含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基,以提供细胞侵袭运动的趋化因子,放置于细胞培养箱,再继续培养24小时;
5.细胞的固定染色:自24孔板中取出Transwell小室,用1xPBS轻轻冲洗3次,再用小棉签轻轻擦去小室底部微孔滤膜上层的细胞,将小室置于固定液(甲醇:冰乙酸=3:1)中放置10分钟,取出小室放入苏木精中浸泡,染色5分钟;
6. 实验结果观察:沿小室底部边缘小心剪下滤膜,显微镜下观察穿过Matrigel及微孔至滤膜背面的滋养细胞,于光学显微镜下计数5个视野的细胞数目,取其平均值;
7、Transwell小室原理示意图:

8、统计学分析
数据统计采用SPSS19.0 FOR WINDOWS软件处理,若方差齐,两组均数比较作两独立样本的t检验;多组间均数比较采用单因素方差分析;进一步组内两两比较,采用最小显著差异t检验(即LSD-t)。若方差不齐,采用秩和检验。
三、结果
各组滋养细胞侵袭状况如图8示:

  首先采用方差齐性检验,P=0.744,所以方差具有齐性;再对两组均数作两独立样本的t检验,P =0.348,差异没有统计学意义,可以认为两组滋养细胞的侵袭能力无差别。

  与对照组(输卵管妊娠滋养细胞组)比较, * P<0.05;与阳性组(甲氨蝶呤)组比较,△P<0.05。
  首先采用方差齐性检验,因P=0.656,所以方差具有齐性;再对多组均数作方差分析,P=0.000,差异具有统计学意义,即可以认为上述5组细胞的侵袭能力有显著差别。
进一步作两两比较(LSD-t法):
  与对照组比较:各加药组与对照组比较均有统计学意义,P<0.05;
  与阳性药比较: 1)中药2.5mg/mL组和甲氨蝶呤组比较,P=0.029,有统计学意义(甲氨蝶呤优于中药2.5mg/mL组);
2)中药5mg/mL 组和甲氨蝶呤组比较,P=0.606>0.05,无统计学意义;
3)中药10mg/mL 组和甲氨蝶呤组比较,P=0.000,有统计学意义(中药10mg/mL组优于甲氨蝶呤组); 
四、讨论
(一)滋养细胞侵袭与胚胎植入
  众所周知,正常宫内早期妊娠时,胚胎着床的一个重要前提就是滋养细胞有节制地侵入子宫内膜基质,若这个侵入过程调节失控就会导致病变。滋养细胞侵蚀与肿瘤细胞的侵袭转移特性有很多相似之处,但是滋养细胞的侵蚀不是无限制的,它受到一系列蜕膜和滋养细胞内的活性因子精确的调控,如细胞黏附分子 (CAM) 和细胞外基质(ECM) 因子、蛋白酶和抑制因子、生长因子、细胞杀伤因子等。它还具有严格的时空限制:侵袭时间且仅仅发生于妊娠早期,侵袭部位仅仅局限于子宫蜕膜、肌层内三分之一[109]。同样,输卵管妊娠时,滋养层细胞粘附并植入输卵管粘膜是胚胎异位着床的先决条件。本实验正是探讨了输卵管妊娠滋养细胞和正常宫内早孕滋养细胞侵袭能力有无不同,以及化瘀消癥杀胚中药复方是否抑制了输卵管妊娠滋养细胞的侵袭能力。
(二)滋养细胞侵袭与MMPs的关系
  细胞穿过基底膜及侵入细胞外基质时,必须对其中的重要成分如基质糖蛋白、各种胶原、以及蛋白多糖进行蛋白酶解,因此判断一种细胞有无浸润活性就取决于它有无分泌蛋白酶的能力。滋养细胞具有浸润性就是由于自身能分泌 MMPs,MMPs是一类锌离子依赖性蛋白水解酶,可降解细胞外基质,为滋养细胞浸润提供必要条件[110]。Kocera等对异位妊娠的研究表明,滋养层细胞可表达MMP l、MMP 2和TIMPs,这些分子参与了异位妊娠的早期植入行为[111]。秦力[112]等研究表明,MMP 2、9、14和TIMP1、2、3于所有绒毛外细胞滋养层细胞(EVCT)中均有表达,在输卵管妊娠时,由于输卵管壁较薄,内膜的蜕膜反应差,MMPs/TIMPs的表达失常可能是输卵管妊娠受精卵着床的可能机制。
(三)滋养细胞侵袭模型的应用
  Matrigel 是一种来源于 EHS 小鼠肉瘤的ECM蛋白,目前常被用于研究细胞的分化、迁移、侵袭行为[113]。在Transwell小室系统中,滋养细胞首先粘附到Matrigel表面,继而通过分泌 MMP消化降解 Matrigel,之后细胞迁移运动穿过滤膜,最后附着在多孔滤膜背面,最后通过计数穿膜细胞个数来评价细胞的侵袭能力及实验药物对细胞侵袭能力的影响。秦立赟为研究滋养细胞的侵袭行为,建立了可保持绒毛外细胞滋养层细胞( EVCT)与蜕膜基质细胞(DSC)生物学特性的共培养细胞模型,在Transwell小室上室的有孔底膜上培养绒毛外细胞滋养层细胞,同时把蜕膜基质细胞培养在下室底面,这样两种细胞各自分泌的激素、相关细胞因子和生长因子、参与浸润过程的蛋白酶和蛋白酶抑制剂在上下室之间可互通交流、相互作用,成功模拟了体内 EVCT 侵袭蜕膜层的状态[114]。章汉旺[115]等利用 Matrigel侵袭试验分析不同浓度胰岛素生长因子(IGF-Ⅱ) 对滋养细胞的侵袭力的影响,结果发现 IGF -Ⅱ可以明显促进原代培养的人早孕滋养细胞的迁移和侵袭力,并随着药物浓度和时间的增加而增强,各组间有显著性差异。
(四)滋养细胞侵袭的调控
  目前对滋养细胞侵袭功能的调控机制仍未能完全阐明,但不管通过何种因素起作用,最终都要通过细胞信号传导途径来调节滋养细胞侵袭功能,目前研究较多的有局部粘附激酶、小分子G蛋白、磷酸肌醇3激酶、丝裂原活化蛋白激酶、JAK/STAT信号转导通路和Smad族的信号蛋白等6个与滋养细胞侵袭力相关的主要信号传导通路[116]。韩雪川[117]等研究认为米非司酮能上调人早孕绒毛组织中TGF2β/smads信号通路的功能状态,从而可能诱导 PAI基因的表达,PAI 1通过抑制细胞外基质的降解而抑制滋养细胞的侵袭、浸润,可能是该药物引起流产的机制之一。
(五)输卵管妊娠滋养细胞侵袭力的研究
  在本课题组前期的实验发现[42],输卵管妊娠滋养细胞可表达MMPs,化瘀消癥杀胚中药复方和甲氨喋呤均能显著上调MMPs的表达,推测化瘀消癥杀胚中药通过上调MMP-2的表达,使输卵管蜕膜组织过度溶解,导致绒毛、蜕膜组织不同程度变性、坏死。本实验在前期实验输卵管妊娠滋养细胞可表达MMPs的前提下进一步设计了输卵管妊娠滋养细胞的侵袭实验,以直观评估中药不同剂量及西药对照组对输卵管妊娠滋养细胞侵袭能力的影响。结果显示,正常宫内早孕滋养细胞和输卵管妊娠滋养细胞的穿膜细胞个数比较(P =0.348),说明二者侵袭能力无差异;而在用化瘀消癥杀胚中药复方干预后的滋养细胞组中,各加药组与对照组比较均有统计学意义(P<0.05);与阳性药比较,甲氨蝶呤优于中药2.5mg/mL组(P =0.029);中药10mg/mL 组优于甲氨蝶呤组(P =0.000);而中药5mg/mL 组和甲氨蝶呤组比较,差异无统计学意义(P =0.606);
  总之,从滋养细胞侵袭能力对比来看,输卵管妊娠和宫内妊娠并无区别,但中药复方对输卵管妊娠滋养细胞的侵袭能力有不同程度的影响,甚至中药10mg/mL 组优于甲氨蝶呤组,这说明中药复方抑制了滋养细胞的侵袭行为,而早期输卵管妊娠同宫内妊娠一样,也是凭借滋养细胞的浸润侵袭而附着于输卵管部位,抑制其侵袭运动可能是阻止妊娠组织进一步的浸润管壁的机制之一。如前所述,滋养细胞侵袭受多种因素的调控,本实验只是粗略模拟了滋养细胞侵袭的结果,而中药复方究竟在侵袭的哪个信号转导通路、环节、相关分子产生作用,则需要更进一步深入研究。

实验五  化瘀消癥杀胚中药复方对输卵管妊娠滋养细胞凋亡能力的影响
一、研究目的与内容
  采用western-blot法检测化瘀消癥杀胚中药复方对输卵管妊娠滋养细胞凋亡蛋白fasl和caspase-3表达的影响,拟从细胞凋亡方面探讨化瘀消癥杀胚中药复方对输卵管妊娠滋养细胞靶部位的作用机制。
二、材料与方法
(一)材料
1. 实验材料
(1)过硫酸胺(APS):Sigma产品
(2)双丙烯酰胺(N-N-甲叉双丙烯酰胺):Sangon产品
(3)丙烯酰胺:Sigma产品
(4)四甲基乙二胺(TEMED):Sigma产品
(5)三羟甲基氨基甲烷(Tris):广州捷倍思,批号20120427
(6)甘氨酸(Glycine):Mbchen产品
(7)十二烷基磺酸钠(SDS):广州捷倍思,批号112428
(8)甲醇:广州化学试剂厂,批号20100303-2
(9)碧波BCA蛋白浓度测定试剂盒:广州浩玛生物科技有限公司,批号 BP311
(10)caspase-3一抗:Santa公司,货号 sc-7148
(11)FAS-L一抗:Santa公司,货号 sc-834
(12)GAPDH一抗及所有二抗:广州威佳科技有限公司
(20)预染蛋白Marker:英国NEB
(21)SuperECL Plus超敏发光液:Thermo,批号 MD15645
(22)5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液:广州浩玛生物科技有限公司,批号111031
(23)小牛血清白蛋白(BSA):广州浩玛生物科技有限公司,20120826
(24)显影粉、定影粉:广州浩玛生物科技有限公司
2.实验溶液的配制
(1) 1.5 M Tris-HCl(pH8.8):称取18.17 g Tris碱,加纯水80mL,缓慢地加浓盐酸至pH8.8(约加3 mL),后加纯水定容至100mL。
(2) 1 M Tris-HCl(pH6.8):称取12.114 g Tris碱,加纯水80mL,缓慢地加浓盐酸至pH6.8(约加8 mL),后加纯水定容至100mL。
(3) 10%(W/V)SDS:称取10 g SDS,加纯水100mL,室温保存。
(4)10%过硫酸胺:称取0.2 g过硫酸胺,溶于2mL纯水中,4℃保存,一周内使用。
(5)30%丙烯酰胺储存液:称取29 g丙烯酰胺,1g甲叉双丙烯酰胺,加纯水100mL,缓慢搅拌至粉末完全溶解,置于棕色瓶中,4℃保存。
(6)10×SDS-PAGE蛋白电泳缓冲液(pH为8.3):称取Tris碱6 g,甘氨酸28.8 g,SDS2 g加纯水200 mL溶解,4℃保存,用时10倍稀释。
(7)10×电转缓冲液:称取Tris碱 12.13 g,甘氨酸57.67 g,加纯水200mL溶解,4℃保存,用时稀释为1×,添加20%甲醇。
(8)TBS溶液:分别量取2 M Tris-HCl(pH7.5)5mL,4 M NaCl 37.5 mL,加纯水定容至1000mL,4℃保存。
(9) TBST溶液:TBS溶液添加0.1% Tween-20,现用现配。
(10)封闭液(5% BSA/TBS):称取1g BSA,TBS溶液20mL溶解,现用现配
3.主要仪器设备
(1)离心机:德国eppendorf公司5410R型
(2)电泳仪:美国Bio-rad公司
(3)纯水器:德国MILLOPORE公司
(4)低温冰箱:日本SANYO公司MDFU5410
(5)超低温冰箱:美国Thermo 995
(6)微量移液器:   0.5?L~10?L(Finnpipette,芬兰)
20?L~200?L(Gilson,德国)
200?L~1000?L(Gilson,德国)
(7)DYCZ-24DN型垂直板电泳仪:北京六一仪器厂
(8)DYCZ-40D型电转移装置:北京市六一仪器厂
(9)电子分析天平:日本岛津AEL-160精度1/10000g
(10)光密度扫描仪:美国BIO-RAD GS-800
(11)超净工作台:哈尔滨东联电子技术开发有限公司
(12)全自动蒸汽消毒锅:日本HIRAYAMA HVE-50
(13)TS-1型脱色摇床:江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司
(14)定性滤纸:杭州新华纸业有限公司
(15)暗盒:汕头市粤华医疗器械厂有限公司
(16)增感屏:上海医疗器械股份有限公司齿科医械厂
(17)X光片:富士医疗用X光胶片,批号:4741008378
(18)台式冷冻恒温振荡器:太仓市实验设备厂 THZ-C-1
(19)PVDF膜:0.22?m,Millipore
4.原代培养的输卵管妊娠滋养细胞同前。
5.实验药物的配制:
化瘀消癥杀胚中药复方均用DMEM培养液稀释,用PH试纸测其PH值(PH反应呈中性),在无菌条件下,过0.22μm微孔滤膜,分别配制成低浓度 (2.5mg/mL)、中浓度(5mg/mL)、高浓度(10mg/m1)的储备液,-20℃保存备用,使用前溶解至室温。
甲氨蝶呤用DMEM培养液稀释为1.5mg/mL,用PH试纸测其PH值(PH反应呈中性),在无菌条件下,过0.22μm微孔滤膜,-20℃保存备用,使用前溶解至室温。
6.实验分组 
实验设中药组(2.5mg/mL、5mg/mL、10mg/mL)、空白对照组(含细胞和全培养基)、阳性对照组(甲氨蝶呤),作用时间均为48小时。
(二)方法
1.细胞复苏、培养、计数、传代:方法同前。
2.观察化瘀消癥杀胚中药复方对输卵管妊娠滋养细胞凋亡蛋白fasl和caspase-3表达的影响
(1)实验原理:
Western Blot技术是通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对目标蛋白质进行分离,然后将凝胶上的蛋白质以电转印的方法转移至固相支持物上(如硝酸纤维素膜等),再用特异抗体作为探针,“显色”用标记的二抗,对靶蛋白进行检测的方法[118]。因而可对样品中的目标蛋白进行鉴定和半定量分析。
(2)实验过程
细胞处理:
将生长状态良好的细胞以1×104个/mL接种于6孔板内,每孔1mL,37℃,5%CO2恒温培养箱中培养2天,弃原培养液,加入无血清的DMEM/F12培养液,置于37℃,5% CO2恒温培养箱中继续培养24h,使细胞生长同步化,弃去培养液,加入不同浓度的中药水提醇沉液,使其终浓度分别为2.5mg/mL、5mg/mL、10 mg /mL,同时设立阳性对照组(甲氨蝶呤组)和空白对照组,每组设立5个重复。然后在37℃,5% CO2、饱和湿度条件下培养48h。
western-blot过程:
(1)蛋白提取
① 倾去细胞上清液,预冷PBS液冲洗两次甩干后,每孔加入200?L蛋白提取液,充分湿润板底,冰上放置20min。
② 用细胞刮刮下细胞,使蛋白提取液积于孔底一边,用200?L枪头反复吹打数次后将溶液转移至预冷的EP管中,冰上静置1h。
③ 4℃,12000rpm离心10min。小心地将上清吸至另一干净的预冷的EP管中,弃去沉淀。
④ BCA蛋白定量法测定蛋白浓度,-80℃保存备用。
(2)BCA法测定蛋白浓度
① 稀释BSA标准品:取7个干净的EP管,分别标记为A→F,其中A管不加入稀释液,B,C,D,E,G管均加入200?L稀释液,而F管中加入400?L稀释液。随后,取2mg/mL的BSA标准品100?L加入A管,使得A管BSA终浓度为2000?g/mL;200?L加入B管,使得B管BSA终浓度为1000?g/mL;从B管中吸取200?L溶液加入C管,使得C管BSA终浓度为500?g/mL;从C管中吸取200?L溶液加入D管,使得D管BSA终浓度为250?g/mL;从D管中吸取200?L溶液加入E管,使得E管BSA终浓度为125?g/mL;从E管中吸取100?L溶液加入F管,使得F管BSA终浓度为25?g/mL;G管中不加入BSA标准液,BSA终浓度为0?g/mL。
② 配制BCA工作液:根据BSA 标准品和待测样品的数量,将试剂A 和试剂B 以50:1 的体积比混匀,具体实验中试剂A量取20mL,试剂B量取0.4mL。
③ 96孔板检测:
1)将稀释好的标记为A-G 的BSA 标准品和待测蛋白样品(原液或稀释液)各25?L分别加到作好标记的96 孔板孔中。
2)每孔加入200 ?LBCA 工作液,充分混匀,盖上96 孔板盖,37℃孵育30 分钟。
3)冷却至室温。
4)用酶标仪测定562 nm 处的吸光值。
5)绘制标准曲线,计算样品中的蛋白浓度。
(3)蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
计算含50μg蛋白的溶液体积,补充纯水至16?L,加入4?L 5×SDS-PAGE 蛋白上样缓冲,混匀,沸水浴100℃加热5min,冰上冷却5min,4℃ 12000 rpm离心2min,以50μg-20?L蛋白上样。然后按以下步骤操作:
① 固定安装玻璃板形成制胶模具,切勿把玻璃弄坏;
② 配制分离胶(12%)
纯水                          1.6mL
30%丙烯酰胺                   2.0mL
1mol/L Tris-HCL(PH8.8)       1.3 mL
10%SDS                       0.05ml
10%过硫酸胺                   0.05ml
TEMED                       0.004ml
③ 加入过硫酸胺和TEMED后立即混匀内容物倒入到固定好的玻璃板中,同时留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加0.5cm)再在胶液面上小心注入一层水(约2—3mm高)以排除气泡和阻止氧气进入凝胶溶液。
④ 分离胶聚合完全后(约45分钟)倾出覆盖水层,再用滤纸吸尽残留水。
⑤ 制备浓缩胶:下列配方配制浓缩胶(5%),在另一小烧杯中配制一定体积及一定浓度的丙烯酰胺溶液,加入TEMED后应立即快速旋动混合物倒入玻璃板中
纯水                            1.4mL
30%丙烯酰胺                    0.33mL
1mol/L Tris-HCL(PH6.8)         0.25mL
10% SDS                        0.02ml
10%过硫酸胺                    0.02ml
TEMED                         0.004ml
总体积                          2mL
⑥ 胶灌入之后将干净的梳子插入到浓缩胶内,注意不要有气泡混入,将凝胶置于室温静置约20min,待胶聚合好,小心拔出梳子,将凝胶固定于电泳装置上
⑦ 往内外电泳槽内加入1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液
⑧ 以加样器取25?L处理好的样品(每个蛋白样品取50μg)注入加样孔中,最后加入预染的蛋白质Marker 6?L。先用恒压60V 使样品进入分离胶(跑平即可),随后将电压提升至120 V继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约0.5cm,然后关闭电源
⑨ 从电泳装置上卸下玻璃板,用刮勺撬开玻璃板,在凝胶上部一角处切去一角,标注加样顺序。
(4)蛋白质的免疫印迹
将电泳结束后的胶片放入转印缓冲液中,将转印膜也放入转印缓冲液中浸润。
① 进行转膜,膜在正极,胶在负极,分别用滤纸3张/面压住胶和膜。转移时电压100伏,转移时间1小时,电转移时会产热,固应在转移装置的外面加入冰块进行除热。
② 转移结束后,卸下电泳装置,把PVDF膜放入盛有5%脱脂奶粉封闭液中,封闭2小时或过夜。
③ 封闭完毕后用TBST洗膜5次,每次间隔5分钟,随后加一抗(其中fas和caspase3 1:800稀释,内参GAPDH 1:500稀释),37℃孵育1.5小时。
④ 洗膜5次,每次间隔5分钟。
⑤ 加辣根过氧化物酶标记二抗(其中fas和caspase3 1:5000稀释,内参GAPDH 1:5000稀释),37℃孵育1小时。
⑥ 洗膜5次,每次间隔5分钟。
(5)蛋白质的化学发光(ECL)检测
将SuperECL Plus超敏发光液试剂盒中A、B两种试剂等体积混合,总体积足够覆盖膜(本实验用2mL);
1min后,吸去洗涤过的膜上的多余缓冲液,然后将混合试剂加在有蛋白质的一面,静止状态下室温中精确孵育3min;
滤纸吸去多余的混合试剂,用保鲜膜将膜包起,轻轻赶走气泡;
将膜放于胶片夹中,有蛋白的一面向上,动作要快,尽量缩短孵育与曝光之间的时间间隔;
关灯,取一张胶片置于膜上,小心关上胶片夹,曝光约15秒。(注:在暗室中,使用安全的红光,曝光时不要移动胶片);
取出胶片后,放在显影剂中漂洗,边洗边观察显色情况,一般约1-2min;
从显影剂中取出胶片,清水中漂洗片刻,放入定影剂中定影,一般约1-2min;
定影剂中取出胶片,放在自来水下冲洗,晾干;
用BIO-RAD GC-800光密度扫描仪对胶片进行扫描并保存。
(6)统计学分析
用Image J分析软件对蛋白含量进行密度分析,以目的蛋白与GAPDH的密度比值作为目的蛋白的相对含量。结果采用 ±s表示;数据统计采用SPSS19.0 FOR WINDOWS软件处理,多组间均数比较若方差齐,采用单因素方差分析;若方差不齐,采用完全随机设计多个样本比较的Kruskal-Wallis H检验。
三、结果
(一)BCA法绘制蛋白标准曲线
以光密度吸收值为横坐标,BSA浓度为纵坐标绘制蛋白标准曲线,酶标仪所测结果及曲线图如下所示。


(二)、化瘀消癥杀胚中药复方对输卵管妊娠滋养细胞FASL和Caspase -3的影响
采用已建立的方法检测各实验组FASL和Caspase-3蛋白的表达,结果如图11。

  首先采用方差齐性检验, P<0.05,因此不满足方差齐性的条件,故采用完全随机设计多个样本比较的Kruskal-Wallis H检验。
  就FASL来说,首先对5组均数作独立样本Kruskal-Wallis H检验,P=0.000,差异具有统计学意义,可以认为上述5组细胞FASL蛋白相对含量之间有显著差别。
进一步作两两比较:
  与对照组相比,化瘀消癥杀胚复方高、中、低剂量组、甲氨蝶呤组与对照组相比均有显著性差异(P<0.05),即无论是中药复方还是甲氨蝶呤均能显著增加FASL的表达;
与西药组相比,化瘀消癥杀胚复方高、中剂量组FASL表达的水平和甲氨蝶呤组无显著性差异(P>0.05),而化瘀消癥杀胚复方低剂量组FASL的表达水平明显低于甲氨蝶呤组(P<0.05);
  就Caspase -3来说,其蛋白相对含量在各组的表达和FASL是一致的。
四、讨论
(一)关于Fasl和Caspase-3
Fas是1989年发现的,1993年正式命名为CD-95分子,属I型跨膜糖蛋白,属于肿瘤坏死因子TNF或神经生长因子NGF 受体家族中的一员。凋亡相关蛋白的配体( Fas ligand,FasL)是一种分子量约为40000的II型跨膜糖蛋白,属于 TNF 家族,它与在胎盘/蜕膜界面的表达Fas的母体免疫细胞结合后,向细胞内传导死亡信号,后者遭受细胞凋亡,从而促成母胎界面的免疫赦免[119]。
  天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate-specific proteinases,Caspases)家族是哺乳动物细胞凋亡的介导和执行者,是一类与CED-3具有序列和结构同源性的蛋白酶。来自细胞内外的凋亡信号首先通过活化不同的Caspase启始因子,再由上游Caspase激活级联下游的Caspase效应分子,最终由效应分子特异性地水解细胞中的一系列底物而导致细胞解体[120]。因此又称其为“死亡蛋白酶”。一般情况下,细胞质中的Caspase-3无活性,仅仅以前体形式存在。细胞受到凋亡信号刺激时Caspase-3被激活,诱导细胞发生凋亡。因此,Caspase-3的表达反映了细胞凋亡水平和导致凋亡始动因素的存在。在已发现的数十种Caspase家族成员中,Caspase-3处于凋亡序列级联反应的下游,是Caspase家族中最重要的凋亡执行者之一, 它负责对全部或部分关键性蛋白的酶切,是多种凋亡刺激信号传递的汇聚点,研究认为,Caspase-3的活化是细胞凋亡进入不可逆阶段的重要标志[121]。另外,Huppertz等发现Caspase-3参与绒毛滋养细胞的转换及合体细胞的融合[122]
(二)细胞凋亡的执行和Fasl、Caspase-3的关系
  细胞接受凋亡调节信号后,凋亡的执行主要有三条下游通路: 一是死亡信号受体途径[123],二是线粒体通路,三是内质网通路。后两者研究均较少。 目前研究最透彻的是Fas/FasL 系统。一旦细胞受到某些凋亡信号的刺激,Fas 通过与其特异性配体FasL 结合而在细胞膜表面发生聚合,形成复合物通过与 FADD结合,后者的氨基酸末端含有另一种接合器元件DED, 再与 Caspase -8 特异的结构域结合并使Caspase -8 形成二聚体而自身激活,进而引起下游Caspase -3等酶系激活启动级联切割程序而导致细胞凋亡。目前,Fas/FasL 系统在母胎免疫耐受方面的研究较多。如Hammer等研究发现母胎界面Fas/FasL的表达主要通过少量的胚胎抗原进入母体后,激活特异性的T淋巴细胞,使其表面表达大量 Fas,而与胎盘接触后,滋养细胞表面的FasL与T淋巴细胞上的Fas作用导致特异性的 T淋巴细胞凋亡,从而产生胎儿特异性的免疫耐受[124]。
(三)宫内正常妊娠和病理妊娠时滋养细胞的凋亡
  正常妊娠存在一定程度的滋养层细胞凋亡,主要以合体滋养层细胞为主。在胚胎发育程中,适度的细胞凋亡有利于绒毛内血管腔和分支形成,被认为对胚胎的正常发育具有积极的保护作用[125]。但胎盘内细胞增殖和凋亡平衡的破坏, 即滋养细胞的过度凋亡则可能直接参与胎盘的剥离,导致流产或早产[126]。
  大量实验研究表明:Fas 多表达于活化的 T 细胞表面[127],FasL在人类妊娠滋养细胞表面有持续性表达[128]。因此可以推测,胎盘 FasL 的表达可能通过诱导母体循环中白细胞的凋亡允许滋养叶细胞侵入子宫肌层而逃避免疫识别,使胎儿移植物得以存活;而表达 Fas 的浸润性滋养叶细胞同样可以与表达FasL的T 细胞结合诱导凋亡,从而限制其浸润深度。
  目前,多个关于流产的实验和临床研究提示自然流产和稽留流产时均存在滋养层细胞凋亡的增加。如张保华[129]研究发现caspase-3在绒毛组织的合体滋养细胞和细胞滋养细胞的胞浆中均有表达,其在自然流产组中的表达明显高于人工流产组(P< 0.05),认为滋养细胞中 caspase-3 基因的表达增高可能是引起自然流产的原因;张艳红[123]认为在自然流产中,绒毛及蜕膜细胞的凋亡受p53 基因及 FasL 的共同调控,凋亡过度可能是其发病的分子机制。朱劲松[130]等通过检测凋亡调控因子 Fas、FasL 在复发性流产 (RSA) 患者胎盘绒毛滋养细胞以及蜕膜中的表达情况,发现RSA组患者胎盘绒毛滋养细胞 FasL 的表达以及蜕膜中 CD3 ( + ) T淋巴细胞 Fas抗原的表达情况均低于正常妊娠组,认为RSA的发生可能与绒毛滋养细胞表面 FasL 表达减少,以及蜕膜中 Fas ( + ) T淋巴细胞凋亡减少有关。
(四)输卵管妊娠滋养细胞的凋亡情况
  同样,在输卵管妊娠时,受精卵种植在输卵管管壁上,并可进一步侵袭上皮进入肌层、粘膜下层而直达母体血管[131]。因输卵管组织蜕膜发育不全,缺乏蜕膜化本身容易引起合体滋养层的细胞凋亡,使合体滋养层失去了提供营养的作用,因此不易于胚胎发育和成长[132],可以推测表达 Fas 的浸润性滋养叶细胞同样可以与表达FasL的T 细胞结合诱导凋亡,从而进一步限制其浸润深度。
  从本实验研究结果来看,与对照组相比,无论是中药复方还是甲氨蝶呤均能显著增加FASL的表达;与西药组相比,化瘀消癥杀胚复方高、中剂量组增加FASL表达的水平和甲氨蝶呤组无显著性差异(P>0.05),而化瘀消癥杀胚复方低剂量组FASL的表达水平明显低于甲氨蝶呤组(P <0.05);就Caspase-3来看,其在各组的表达和 FASL是一致的,具体如上述。据此可以推测, 化瘀消癥杀胚中药复方诱导输卵管妊娠滋养细胞凋亡可能是通过上调细胞膜表面的FasL 蛋白的表达,当Fas/Fas系统被激活后,将凋亡信号由胞外传入胞内,在连接分子的媒介下,汇合于caspase-3, 再由caspase-3 催化诸多与凋亡形成有关的靶分子分解,最终导致细胞凋亡事件的发生。
  综上所述,细胞凋亡是一个多因素控制的精密的过程,启动细胞凋亡的因素可源于细胞外,也可能源于细胞内环境的改变,是否存在一条或几条诱导细胞凋亡的主要信号通道、输卵管妊娠与细胞凋亡的因果关系以及化瘀消癥杀胚中药复方确切的机制仍是有待进一步寻求解答的问题。
实验六  化瘀消癥杀胚中药复方对输卵管妊娠滋养细胞ER、PR表达的影响
一、研究目的与内容
  通过实时荧光定量PCR法检测化瘀消癥杀胚中药复方对输卵管妊娠滋养细胞ER、PR表达的影响,拟从性激素受体的表达方面探讨化瘀消癥杀胚中药复方对输卵管妊娠滋养细胞靶部位的作用机制。
二、材料与方法
(一)材料
1.实验材料
(1)Trizol                            美国Invitrogen公司
(2)氯仿                            广州文睿科学仪器有限公司
(3)无水乙醇                        广州文睿科学仪器有限公司
(4)异丙醇                          广州文睿科学仪器有限公司
(5)DEPC                            广州科因生物科技有限公司
(6)EB                              广州科因生物科技有限公司
(7)6×loadingbuffer                  宝生物工程(大连)有限公司
(8)SYBR ?Premix EX Taq?Ⅱ         宝生物工程(大连)有限公司
(9)引物                            宝生物工程(大连)有限公司
(10)PrimeScript?RT reagent Kit With DNA Eraser 宝生物工程(大连)有限公司
2.实验溶液的配制
(1)0.1?PC水:取市售DEPC 0.1ml,加入100ml双蒸水中,剧烈摇匀,室温静置过夜,然后高压灭菌,4℃保存。
(2) 10×TAE电泳缓冲液:称取试剂Tris48.4g,Na2EDTA?2H2O 7.44g,置于1L烧杯中,向烧杯中加入约800ml的去离子水,充分搅拌溶解;再加入11.42ml醋酸,然后加去离子水定容至1L,室温保存。
3.主要仪器
超净工作台            苏州安泰空气技术有限公司
CO2培养箱             日本SANYO公司
高速冷冻离心机        美国Beckman公司
2400PCR仪             美国ABI公司
7500-RealtimePCR仪    美国ABI公司
电泳仪                北京市六一仪器厂
核酸蛋白测定仪        上海琪特分析仪器有限公司
凝胶成像系统          美国Bio-Rad公司
4.培养的输卵管妊娠滋养细胞同前。
5.实验药物的配制:
化瘀消癥杀胚中药复方均用DMEM培养液稀释,用PH试纸测其PH值(PH反应呈中性),在无菌条件下,过0.22μm微孔滤膜,分别配制成低浓度 (2.5mg/mL)、中浓度(5mg/mL)、高浓度(10mg/m1)的储备液,-20℃保存备用,使用前溶解至室温。
甲氨蝶呤用DMEM培养液稀释为1.5mg/mL,用PH试纸测其PH值(PH反应呈中性),在无菌条件下,过0.22μm微孔滤膜,-20℃保存备用,使用前溶解至室温。
6.实验分组:实验设中药组(2.5mg/mL、5mg/mL、10mg/mL)、正常对照组(含细胞和全培养基)、阳性对照组(甲氨蝶呤 ),作用时间均为48h。
(二)方法
1.细胞复苏、培养、计数、传代:同前。
2.检测化瘀消癥杀胚中药复方对输卵管妊娠滋养细胞ER、PR表达的影响
(1)实验原理
  常规PCR包括三个基本过程:①变性,即在较高温度(93-98℃)使双链模板DNA变性解链成单链DNA,以提供复制的模板;②退火,即在较低温度37-65℃使加入的引物与待扩增DNA区域特异性结合,以提供DNA复制起始的3-OH;③延伸,在适当温度下(70-75℃),根据碱基互补配对的原则,DNA聚合酶从特异性结合到DNA模板上的引物3-OH端开始,按照待扩增区域的核苷酸序列,进行DNA链的延伸,合成新的DNA分子。如此循环往复,经过n轮循环后,靶DNA的拷贝数理论上呈2n增长。随着反应进行,体系中各成分的消耗使得靶序列并非按指数方式扩增,因此在起始模板量与终点的荧光信号强度间没有可靠的相关性[118]。实时荧光定量(Real-time PCR)PCR采用新参数-Ct值,其定量根本原理是-Ct值与起始模板拷贝数的对数成线性反比关系,-Ct值能反映实际PCR反应过程的扩增,并且不受试剂消耗等因素的影响,因此利用-Ct值判断的起始模板拷贝数更加准确。
(2)实验过程
细胞处理:
  取输卵管妊娠滋养细胞消化、收集并制成单细胞悬液,按密度2xl04个/mL接种于培养皿中,培养24小时,待细胞贴壁后分组处理,继续培养48小时,收集细胞。
PCR过程:
(1)总RNA提取
① 选取上述处理后的细胞,每孔加入1ml Trizol裂解细胞5分钟;
② 收集各孔细胞至2ml EP管中,加入0.2ml氯仿,盖好管盖,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟;
③ 4℃,12000rpm离心10分钟,样品会分成三成:粉色的有机相,中间层和上层无色的水相,RNA主要在水相,吸取上层水相转移至新管中;
④ 在得到的水相溶液中加入等体积的异丙醇,混匀,室温放置20分钟;
⑤ 4℃下,1200rpm离心10分钟,收集RNA沉淀;
⑥ 加入1ml 75%乙醇洗涤两次,超净台吹干;
⑦ 加入适量RNase-free-ddH2O溶解沉淀。
(2)基因组DNA的去除
  使用RNase-free的DNase ?,按以下体系配置反应液,37℃孵育30分钟,65℃灭活10分钟。

(3)总RNA纯度及完整性检测  
① 纯度检测:取1μl RNA样品50倍稀释,在核酸蛋白分析仪上测定OD260及280的值,OD260/OD280的比值在1.8-2.0之间,,可以认为制备的RNA纯度较好。
② 完整性检测: RNA样品1μl与6×Loading Buffer充分混匀,1%琼脂糖凝胶电泳120V×15分钟,Bio-Rad凝胶成像系统观察总RNA的5s 、 18s和28s三条条带,三条条带完整且28s:18s=2:1说明总RNA完整性较好。
(4)逆转录
① 在无RNase 的PCR管中配置下列溶液.

② 将溶液吹打均匀,85℃保温5分钟,使RNA变性。随后立即置于冰上冷却防止其复性;
③ 在PCR管中加入如下试剂:

④ 将上述20μl反应溶液置于PCR仪中30℃,10分钟;42℃,60分钟;85℃,10分钟。
(5)荧光定量PCR步骤
① 检测序列片段大小
内参片段: β-actin-275bp
目的片段:  ER-104bp;PR-80bp;
② 设计的引物:

③ 反应体系:

④ 反应条件:            
95℃ 预变性2分钟; 95℃ 变性15秒,60℃退火及延伸 32秒,40 个循环;
3.统计分析
数据统计采用SPSS19.0 FOR WINDOWS软件处理,计量资料以 ±s表示,多组间均数比较若方差齐,采用单因素方差分析,进一步组内两两比较,采用最小显著差异t检验(即LSD-t);若方差不齐,采用非参数检验。
三、结果(各组的扩增曲线及溶解曲线详见附图)

(二)ER、PR mRNA表达水平

(三)不同处理组输卵管妊娠滋养细胞ER、PR的表达水平

① 就ER来看,首先对5个实验组ER表达水平进行方差齐性检验,P=0.08>0.05,所以方差具有齐性,然后对多组均数作方差分析,P=0.000,差异具有统计学意义,即可以认为在上述5个实验组之间ER表达水平有显著差别。
进一步作两两比较(LSD-t法):
1)化瘀消癥杀胚复方高、中、低剂量组及甲氨蝶呤组与对照组相比均有显著性差异(P<0.05),即无论是中药复方还是西药均能显著降低ER的表达,且随着剂量的增高,其作用明显增强,呈剂量依赖的趋势;
2)与西药组相比,化瘀消癥杀胚复方高、中、低剂量组降低ER表达的水平均不及甲氨蝶呤组(P<0.05)。
② 就PR来看,首先对5个实验组PR表达水平进行方差齐性检验,P=0.094>0.05,所以方差具有齐性,然后对多组均数作方差分析,P=0.000,差异具有统计学意义,即可以认为在上述5个实验组之间PR表达水平有显著差别。
进一步作两两比较(LSD-t法):
1)化瘀消癥杀胚复方高中低剂量组及甲氨蝶呤组与对照组相比均有显著性差异(P<0.05),即无论是中药复方还是西药均能显著降低PR的表达,且随着剂量的增高,其作用明显增强,呈剂量依赖的趋势;
2)与西药组相比,化瘀消癥杀胚复方中、低剂量组降低PR表达的水平均不及甲氨蝶呤组(P<0.05),而化瘀消癥杀胚复方高剂量组降低PR表达的水平和甲氨蝶呤组相比无显著性差异(P>0.05)。
四、讨论
(一)ER、PR在妊娠中的作用
  雌、孕激素对维持正常妊娠、促进胚胎发育起着至关重要的作用,雌、孕激素的生物活性有赖于激素和靶组织受体的相互作用,雌、孕激素受体(ER、PR)是转录因子中类固醇受体超家族的成员。雌、孕激素与靶器官细胞核的相应受体相结合,继而启动一系列蛋白的合成而发挥生物学效应。雌、孕激素对靶器官的调节作用除取决于雌孕激素水平外,还与其受体的特异性、亲和力及组织局部受体含量和受体蛋白质消耗、合成的速度有关。雌激素在转录水平诱导ER、PR产生,使ER、PR上调,而孕酮在转录和转录后水平使两者下调,两者保持动态平衡和精细比值以维持继续妊娠[133]。孙岚等采用细胞培养结合免疫细胞化学ABC法检测人胎盘及培养的人胎盘绒毛合体、细胞滋养层细胞中雌激素α、β受体表达,结果发现人胎盘滋养层细胞存在雌激素α、β受体,这为研究雌激素对人胎盘滋养层细胞的功能调控提供了形态学依据[134]。ER和 PR表达下降导致 ER mRNA、 PR mRNA蛋白表达下降,从而使子宫内膜容受性下降、胚泡不能着床或胚胎着床后发育不良导致流产[135]。雌、孕激素受体在子宫内胚泡着床过程所起的重要作用已得到公认,但有关 ER、PR在输卵管妊娠中所起的作用国内外报道较少。
(二)ER、PR与输卵管妊娠
  有研究者认为,输卵管妊娠患者的输卵管粘膜上皮孕激素受体缺乏,导致孕激素作用失调是可能的病因之一。Jolande报道, 在输卵管妊娠时,由于输卵管管壁薄,蜕膜反应较差,输卵管ER、PR的表达较差,所以用米非司酮治疗异位妊娠的疗效并不理想[136]。田冬珍研究发现:异位妊娠输卵管组织薄弱, 蜕膜反应较少,无或仅有极少量孕激素受体,缺乏米非司酮的靶组织[137]。郑萍等也认为,虽然异位妊娠与早孕妊娠有相同的生理基础,但研究表明异位妊娠输卵管孕激素受体的阳性表达率偏低,阳性强度亦很低,缺乏米非司酮作用的靶组织,故用米非司酮治疗异位妊娠缺乏理论依据[138]。王舟等研究结果显示:输卵管妊娠时ER阳性例数明显增多、表达强度明显增强,而PR表达与正常输卵管无差别,提示输卵管黏膜对雌激素敏感性明显高于其对孕激素敏感性,推测患者输卵管局部高雌激素状态导致输卵管妊娠[139]。
  既往研究表明,雌孕激素的协同作用是受精卵维持向宫腔方向正常运行的重要因素, ER、PR在正常输卵管黏膜中高表达,可避免受精卵在输卵管着床,起到保护输卵管的黏膜屏障作用[140]。 如输卵管黏膜ER、 PR 表达下降或失调,局部低落的激素环境延缓受精卵在输卵管内的移行过程,可能发生与宫内妊娠相似的输卵管着床及妊娠[141]。孙佳琦[40]用免疫组化法检测用药前后输卵管黏膜组织中的ER、PR,结果发现活血化瘀消癥杀胚中药可升高妊娠输卵管黏膜 PR 表达水平,对妊娠输卵管黏膜ER表达水平无影响(P>0.05),认为活血化瘀消癥杀胚中药降低输卵管黏膜对于胚胎组织的容受性可能是其发挥杀胚的效应途径之一。
  以上从不同方面研究了ER、PR在输卵管粘膜中的表达,那么,其在输卵管妊娠滋养细胞中的表达如何? 刘玲[42]采用化瘀消癥杀胚中药复方含药血清干预输卵管妊娠滋养细胞,发现中药中剂量组和甲氨喋呤组均能显著下调ER、PR的表达,认为其能从受体水平拮抗雌孕激素,导致绒毛组织变性、坏死,是其发挥消癥杀胚效应的作用机制之一。
(三)本研究结果分析
  本研究结果表明, ER、PR在输卵管妊娠滋养细胞m-RNA水平中均有表达。就ER来看,化瘀消癥杀胚复方高、中、低剂量组及甲氨蝶呤组与对照组相比均有显著性差异(P <0.05),即无论是中药复方还是西药均能显著降低ER的表达,且随着剂量的增高,其作用明显增强,呈剂量依赖的趋势;与西药组相比,化瘀消癥杀胚复方高、中、低剂量组降低ER表达的水平均不及甲氨蝶呤组(P <0.05)。就PR来看,化瘀消癥杀胚复方高中低剂量组及甲氨蝶呤组与对照组相比均有显著性差异(P <0.05),即无论是中药复方还是西药均能显著降低PR的表达,且随着剂量的增高,其作用明显增强,呈剂量依赖的趋势;与西药组相比,化瘀消癥杀胚复方中、低剂量组降低PR表达的水平均不及甲氨蝶呤组(P <0.05),而化瘀消癥杀胚中药复方高剂量组降低PR表达的水平和甲氨蝶呤组相比无显著性差异。(P>0.05)
  本研究的结果进一步印证了刘玲前期的实验结论,即ER、PR在输卵管妊娠滋养细胞m-RNA水平中均有表达,化瘀消癥杀胚复方可不同程度的降低二者的表达,滋养细胞失去雌、孕激素的支持,输卵管妊娠难以继续维持,从而在宏观上表现出“杀胚”的效应。然而,其“杀胚”的启动和执行究竟是通过哪个细胞信号转导通路实现的,ER、PR表达的降低是否只是其一系列作用的结果,则需要进一步的更深入细致的研究。

结    语

  近年来,随着输卵管妊娠临床发病率的逐渐提高,中医药保守治疗的优势和效果日渐被临床医生所重视,无论是关于输卵管妊娠中医病因病机的探究,还是有效治疗方药的筛选应用、中医药介入干预的适应症和时间节点的把握,都涌现出了大量探索和研究的成果。然而,大部分的研究仍着眼于临床观察及医家的个人经验等,关于输卵管妊娠的基础实验研究较少,而且输卵管妊娠一直缺乏理想的动物模型,因此,我们提出了如下假说:早期异位妊娠是多种发病机制共同作用的结果,在不同的发病部位、不同个体、同一个体不同时期的发病机制可能不同,但“滋养细胞-侵袭微环境”是共同的关键窗口,是异位妊娠发生的“种子”和“土壤”的关系,化瘀消癥杀胚中药复方可能通过影响滋养细胞侵袭微环境来干预滋养细胞向周围组织的侵袭治疗早期异位妊娠。这个“微环境”不仅包括母体方面如种植部位局部的细胞外基质、妊娠相关免疫因子等构成的网络,同样可能与胚胎滋养细胞本身固有的功能所形成的“微环境”,如滋养细胞的侵袭能力、凋亡能力、分泌能力等有着密切的关系。
  在前期成功建立输卵管妊娠细胞模型的基础上,本研究进一步探索了输卵管妊娠发病的微环境调控机制及化瘀消癥杀胚中药复方对输卵管妊娠滋养细胞的作用靶点,这将为输卵管妊娠的早期诊断和临床治疗方案的改善提供理论基础和依据,对明确化瘀消癥杀胚中药复方的作用也有着一定的意义或作用。
一、创新点
(一)首次将体外培养的输卵管妊娠与正常宫内早孕的滋养细胞生物学特性进行比较
基于对“在正常位置和异常位置植入的滋养细胞本身有什么不同”的思考,本研究采集了宫内正常早期妊娠的绒毛和输卵管妊娠的绒毛,严格统一培养条件和培养环境,进行细胞体外培养,最终成功培养了两种滋养细胞,并进行细胞鉴定和传代,从生长活性、微观形态、侵袭特性等三个方面比较了输卵管妊娠与正常宫内早孕的滋养细胞生物学特性,并成为后续研究的工具和基础。目前国内外尚未见到同类的研究文献报告。
(二)建立了输卵管妊娠滋养细胞的侵袭模型
和肿瘤细胞不同,无论是宫内妊娠还是宫外妊娠,滋养细胞的侵袭都是有着严格的时空限制的,而不是无限的增殖浸润,在肿瘤学的研究中常常用到transwell小室模型来评判某种肿瘤细胞的侵袭能力,本实验借助了这种模型用来初步估计具有“良性侵润”性质的滋养细胞的侵袭力,以及化瘀消癥杀胚中药复方是否通过抑制了这种侵袭行为而表现出消癥杀胚的效果。
(三)从侵袭、凋亡、分泌等不同侧面寻求化瘀消癥杀胚中药复方有效性的依据
中药复方的药效作用是多靶点多层次的,很难确定究竟是哪种成分起到了治疗的效果,因此研究的方法及角度也应该多方位多层面的展开。本研究正是试图从滋养细胞的侵袭、凋亡、分泌等不同侧面来寻求化瘀消癥杀胚中药复方有效性的依据,这将有助于丰富输卵管妊娠的研究领域和研究方法。
二、结论
  通过采用滋养细胞的体外培养、鉴定、传代、CCK-8法绘制生长曲线、扫描电镜及透射电镜观察、Transwell小室方法、蛋白质印迹法(Western Blot)、实时荧光定量(Real-time)PCR等不同的研究方法,最终得出了如下研究结论:
(一)成功地建立了输卵管妊娠滋养细胞体外培养模型,为后续实验研究提供了足够数量和质量的研究载体;
(二)体外培养的输卵管妊娠与正常宫内早孕滋养细胞的生长周期大致相同;扫描电镜下二者外观形态无明显差异;二者侵袭能力亦无明显差异;
(三)化瘀消癥杀胚中药复方可显著降低输卵管妊娠滋养细胞的侵袭能力,高剂量中药组甚至优于阳性对照组的效果,推断化瘀消癥杀胚中药复方下调输卵管妊娠滋养细胞的侵袭能力可能是避免其进一步浸润妊娠输卵管的机制之一;
(四)化瘀消癥杀胚中药复方可显著增加输卵管妊娠滋养细胞凋亡相关蛋白Fasl和caspase-3的表达,这为本课题前期研究成果“化瘀消癥杀胚中药复方可诱导滋养细胞凋亡”的理论提供了又一确切证据;化瘀消癥杀胚中药复方可能通过启动Fas/FasL系统凋亡通路最终完成了凋亡事件而在宏观上表现出“杀胚”效应;
(五)化瘀消癥杀胚中药复方能显著降低输卵管妊娠滋养细胞ERm-RNA、PRm-RNA的表达,表明化瘀消癥杀胚中药复方能从性激素受体水平拮抗雌、孕激素,导致异位妊娠绒毛组织变性、坏死,可能是它发挥消癥、杀胚功能的作用机理之一。
三、不足与展望
(一)不足之处
1. 由于研究时间较紧张,以及收集标本等因素的考虑,未能将宫内早孕滋养细胞作为化瘀消癥杀胚中药复方干预的对象,以便更深入的探索中药复方在两种滋养细胞的具体作用位点有何不同,对两种滋养细胞的雌孕激素受体的影响,甚至可以考虑同时培养自然流产的绒毛滋养细胞来作对照研究,可能更有意义。
2. 滋养细胞侵袭受多种因素的调控,本实验只是粗略模拟了滋养细胞侵袭的结果,而中药复方究竟在侵袭的哪个信号转导通路、环节、相关分子产生作用,则需要更进一步深入研究。
3. 关于“化瘀消癥杀胚中药复方对输卵管妊娠滋养细胞凋亡的影响”研究,仅仅检测Fasl和caspase-3的表达尚不能足以说明细胞凋亡是启动了线粒体途径还是死亡受体信号途径,若是再加上Caspase -9(线粒体途径凋亡的启动因子)、Caspase -8(死亡受体途径的启动因子)的测定,结论将更为完善;
4. 关于中药复方剂型选择的问题。目前,对于中药干预体外培养的细胞,尚无统一的认识。应用较多的大概有以下两种方法:①直接添加法:这种方法有一定的局限性,因为中药粗制剂中的有效成分并不一定是其在人体内发挥作用的真正有效组分,使用单纯粗制剂直接体外实验,比较难以取得与体内药物作用一致的结果。另外,直接将中药复方加入体外细胞培养液的方法,更易受制剂杂质、渗透压、电解质、pH值等因素的影响;②含药血清方法:这种方法可避免直接添加法的一系列干扰因素,其优点是不仅能反映中药复方及其代谢产物的药理效应,还可以反应可能由药物诱导的机体内源性成分产生的作用[142],然而,由于技术水平等原因,含药血清在细胞培养液中的浓度一般不可超过20%,这导致体外培养的血药浓度难以达到体内真实血药浓度水平。目前,用含药血清法进行细胞培养的实验,大多报道是采用动物含药血清,鲜见采用含药人血清的报告[63]。因此,这种方法也并不能最大限度地模拟体内环境。本实验选用了中药水提醇沉液直接添加的方法,虽然严格控制了制剂过程中的灭菌等环节,但由于以上所述方法本身的局限性,仍可能会一定程度上影响药物真实的效果。
(二)展望
1. 在下一步的研究中,应将宫内早孕滋养细胞以及自然流产的绒毛滋养细胞同时作为化瘀消癥杀胚中药复方干预的对象,以便更深入细致的探索中药复方在两种滋养细胞的作用位点有何不同,对两种滋养细胞的雌孕激素受体的影响等。
2. 积极探索深化输卵管妊娠分子信号转导等领域的研究,阐明其确切的微观病理机制以及中药作用的确切环节和位点,为中医药的有效性提供更明确的依据。
3.进一步改良作用于细胞模型的中药剂型,期望其不仅能最大限度模拟人体血药环境,而且对细胞影响较轻微。
4.继续深入研究输卵管妊娠滋养细胞本身固有功能所构成的“微环境”的病理意义,仍可以宫内正常早孕胚胎的着床和子宫内膜的容受为切入点和对照,阐明胚胎异位着床时输卵管的局部发生的分子事件及级联反应的网络,为中药复方的确切机制提供客观依据,为中药保守治疗早期异位妊娠获得国际医学的认可做出必要的准备工作。

 

参考文献 略

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