化瘀消癥杀胚法对输卵管妊娠影响

作者:袁硕|邓高丕
2015-4-22 阅读

中文摘要

引言:
  孕卵在子宫腔以外部位种植、发育称为异位妊娠。近年来,随着人工流产、盆腔炎患者的增多,发病率有上升趋势,已经成为妇科临床中的常见病和多发病之一。据资料统计,异位妊娠发病率占所有已知怀孕总数的1%[1]以上,其中大部分为输卵管妊娠(95%)。
中医目前认为其发病机理是少腹血瘀证[3],故多采用活血化瘀、消癥杀胚方药对早期输卵管妊娠进行治疗。应用由宫外孕Ⅰ号方(丹参、赤芍、桃仁)加紫草、天花粉等组成的化瘀消癥杀胚的复方对符合适应症的输卵管妊娠患者治疗,同时配合口服中成药、中药散剂外敷及中药针剂静滴,在临床治疗上已取得较好的效果,使这部分患者避免了因手术而承受的痛苦,减少了术后并发症,同时最大限度保全了患者的生育功能。

1.临床部分
目的:
  通过前瞻性的随机对照研究,从临床有效性方面论证中医药在治疗输卵管妊娠的疗效及优势,评价原制定的“中西医结合输卵管妊娠治疗方案”的正确性和可行性,为建立规范、量化、易推广、能够被国内妇科同行广泛认可的输卵管妊娠治疗方案提供可参考的临床依据。

研究方法:
  拟选择2009年1月至2010年12月间,临床上相同辨病分期、辨证分型,按病情影响因子评分模型实施评分后属于相同用药范围内的,适合药物保守治疗的,β-HCG为阳性的输卵管妊娠病例,按单盲法、不等随机对照研究(2:1),将患者分为观察组和对照组。观察组按照“输卵管妊娠中西医结合治疗方案”治疗,对照组用西药米非司酮治疗。通过对比两组间的有效率、有效病例的血β-HCG值下降时间及疗程,探讨中西医结合治疗输卵管妊娠的优势及可行性。

研究结果:
(1)纳入试验病例情况:根据诊断标准、纳入标准及排除标准,2009年1月至2010年12月共收集符合药物保守治疗的输卵管妊娠病例184例,其中符合纯中药保守治疗119例,观察组(中-观察)82例,对照组(中-对照)37例;符合中西医结合保守治疗65例,观察组(中西-观察)45例,对照组(中西-对照)20例。
(2)病情影响因子情况:184例符合保守治疗的输卵管妊娠病例中,年龄在25-29岁年龄段所占比例最大,达37.5%;停经时间在43-56天之间所占比例最大,达52.72%;腹痛情况表现为隐痛者所占比例最大,达49.46%;B超下包块最大径<3cm者所占比例最大,达73.37%;B超下出血最大径<3cm者所占比例最大,达76.63%;初始血β-HCG值<1000 IU/L者所占比例最大,达71.2%。病情影响因子总积分,中-观察组为6.96±1.13分,中-对照组为7.19±1.15分;中西-观察组为8.49±0.97分,中西-对照组为8.40±1.05分。
使用t检验,符合药物保守治疗的输卵管妊娠,观察组和对照组在年龄、停经时间、B超下包块最大径、B超下出血最大径、初始血β-HCG值和病情影响因子比较,差异无统计学意义(P>0.05),两组具有可比性。

(3)临床疗效研究结果:中-观察组有效率为81.71%,中-治疗组有效率为64.86%,两组比较,差异具有统计学意义(P<0.05);中西-观察组有效率为68.89%,中西-对照组有效率为60%,两组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。
  中-观察组有效病例实际用药时间为10.76±5.92天;中-对照组有效病例实际用药时间为11.25±4.14天,两组比较,差异无统计学意义(P>0.05);中西-观察组有效病例实际用药时间为16.03±5.60天,中西-对照组有效病例实际用药时间为13.17±4.73天,两组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。
  中-观察组有效病例血β-HCG值下降至50%的时间为4.66±2.07天,下降至10%的时间为9.28±3.40天;中-对照组有效病例下降至50%的时间为5.58±3.19天,下降至10%的时间为11.17±4.99天,两组血β-HCG值下降至50%时间比较,差异无统计学意义(P>0.05),下降至10%的时间比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。中西-观察组有效病例血β-HCG值下降至50%的时间为5.87±2.88天,下降至10%的时间为12.52±4.19天;中西-对照组血β-HCG值下降至50%的时间为6.00±2.66天,下降至10%的时间为12.50±4.52天,两组血β-HCG值下降至50%时间比较,差异无统计学意义(P>0.05),下降至10%的时间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。

2.实验部分
目的:
  本研究拟从细胞凋亡率及凋亡相关蛋白等方面探讨化瘀消癥杀胚复方对输卵管妊娠滋养细胞靶部位的作用机制。这对丰富中医妇科学的基础理论,找寻中医治疗理论依据有着重大的意义,并为探索化瘀消癥杀胚复方的药效物质奠定研究基础。

研究方法:
(1)滋养细胞体外培养:拟选择符合药物治疗的早期输卵管妊娠患者的输卵管妊娠绒毛组织,采用以体外培养的人输卵管妊娠滋养细胞作为研究载体。

(2)含药血清的制备
①化瘀消癥杀胚复方水煎剂的制备
中药浓缩成剂量为1.5g/ml的药液,-20℃保存备用。
②含药血清的制备
将大鼠分为化瘀消癥杀胚复方高、中、低剂量组,分别灌胃7天,日两次;甲氨喋呤组,末日采血前肌注甲氨喋呤;生理盐水组,一直予灌胃生理盐水。
末次给药1小时后在麻醉下行腹主动脉采血,将同组大鼠血清混合,灭活、除菌后,-20℃保存,以备体外培养绒毛滋养层用。
③指标检测
一般情况观察:每周测量3次体重、饮食量、饮水量,每日观察小鼠精神状态、活动力、反应,大便形态,腹泻等。
生殖器官湿重:解剖当日,取大鼠的子宫、卵巢进行称重。

(3)三组含药血清与体外培养的滋养细胞作用72h后,通过①采用流式细胞法(FCM)检测细胞凋亡率;②蛋白质印迹法(Western Blot)检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达。

研究结果:
(1)输卵管妊娠滋养细胞培养
①细胞形态学:大部分细胞伸展呈圆形,1h后可见部分细胞贴壁,24h后大部分细胞贴壁,5、6天细胞数量明显增多,呈三角形,连接成片,部分呈长梭形。可见细胞为上皮样细胞形态,呈片状铺展生长。
②免疫荧光染色:细胞胞浆中有CKl8阳性信号,未见波形蛋白信号。
③滋养细胞分泌功能:传代培养过程中的细胞培养液,通过化学发光法可检测出β-HCG表达。
④细胞生长曲线:6天为滋养细胞的对数生长期,12天后即进入平台期。

(2)化瘀消癥杀胚复方含药灌胃对大鼠的影响
  与同一时间生理盐水组比较,化瘀消癥杀胚复方高、中、低剂量组大鼠体重从开始饲养/用药第4天/用药第7天差异无统计学意义(P>0.05);与同一时间生理盐水组比较,化瘀消癥杀胚复方高、中、低剂量组大鼠饮水量的差异无统计学意义(P>0.05);在饲养的第7天,中药高剂量组的大鼠进食量下降,与同一时间的生理盐水组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。
  与生理盐水组比较,化瘀消癥杀胚复方高、中、低剂量组,甲氨喋呤组大鼠在按照实验方案用药后,其子宫湿重及卵巢湿重的差异无统计学意义(P>0.05)。

(3)化瘀消癥杀胚复方含药血清对输卵管妊娠滋养细胞的细胞凋亡的影响
①滋养细胞与5%含药血清共同作用72h后,可提高滋养细胞的凋亡率,且中药的影响作用更显著。甲氨喋呤组与生理盐水组比较,细胞凋亡率上升,差异具有统计学意义(P<0.05);化瘀消癥杀胚复方组与生理盐水组凋亡率比较,细胞凋亡率上升,差异具有显著统计学意义(P<0.01);与甲氨喋呤组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。
②滋养细胞与5%含药血清共同作用72h后,可降低Bcl-2蛋白表达量。甲氨喋呤组与生理盐水组比较,Bcl-2蛋白表达量降低,差异具有统计学意义(P<0.05);化瘀消癥杀胚复方组与生理盐水组比较,Bcl-2蛋白表达量降低,差异具有显著统计学意义(P<0.01);与甲氨喋呤组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。
③含药血清与滋养细胞共同培养72h后,Bax蛋白表达量未见有明显变化。两组含药血清与生理盐水组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。
④化瘀消癥杀胚杀胚中药能使Bcl-2/Bax比例降低,从而起到促进凋亡的作用。

研究结论:
1.通过与纯西药组相比较,证实在符合中西医保守治疗输卵管妊娠范围内患者,依照“输卵管妊娠中西医结合治疗方案”进行治疗,治疗效果切实,副作用少。
2.“输卵管妊娠中西医结合治疗方案”仍有需要优化和完善的部分,如设立保守治疗的血β-HCG值上限,或动态血β-HCG值波动上限。
3.本研究成功地建立了输卵管妊娠滋养细胞体外培养模型,证实其可为其他的实验研究提供足够量的研究载体。
4.本研究探讨了化瘀消癥杀胚复方对输卵管妊娠滋养细胞细胞凋亡的影响。结论:化瘀消癥杀胚复方提高输卵管妊娠滋养细胞细胞凋亡率,诱导滋养细胞凋亡可能是其发挥杀胚效应的机制之一。
5.本研究探讨了化瘀消癥杀胚复方对输卵管妊娠滋养细胞凋亡相关蛋白表达的影响。结论:下调Bcl-2的表达,使Bcl-2/Bax比例下降,诱导凋亡的发生可能是其发挥杀胚效应的机制之一。

关键词 化瘀消癥杀胚法;中西医结合治疗方案;输卵管妊娠;临床研究;实验研究

引  言

  受精卵于子宫腔以外着床发育称异位妊娠,是妇科最常见的急腹症之一。近年来,异位妊娠的发病率呈明显上升趋势。根据统计资料,异位妊娠发病率占所有怀孕总数的1%[1]。其中以输卵管妊娠最为常见,占异位妊娠的95%左右。目前越来越多有生育要求的患者要求保留输卵管,因此,非手术治疗日益受到重视。随着现代检测技术的进步和妇科医生对本病警惕性的提高,输卵管妊娠的早期诊断率已大大提高,临床所使用的多种非手术疗法治疗早期输卵管妊娠也达到一定的疗效,使部分患者避免了因手术而承受的痛苦,减少了术后并发症,同时最大限度保全了患者的生育能力。
  目前异位妊娠主要非手术治疗手段包括:期待疗法;西药治疗:甲氨喋呤、米非司酮、5-氟尿嘧啶等;中药治疗,主要原理是活血化瘀、消癥杀胚,主要成分有蜈蚣、紫草、花粉、当归尾、川芎、赤芍、丹参、牡丹皮、水蛭、乳香、黄芪、甘草等。宫外孕I号、Ⅱ号方为治疗异位妊娠的经典方。
  中医认为,异位妊娠的发病机理与少腹宿有瘀滞,冲任胞脉、胞络不畅,或先天肾气不足,后天脾气受损等有关。其病机本质是少腹血瘀证,治宜活血化瘀,消癥杀胚。宫外孕I号方活血化瘀,扩张血管,增加血流量,促进新陈代谢,软坚散结,促进瘀血及包块吸收;能够促进纤维蛋白原在肝脏合成,降低血浆纤维蛋白原溶解活性,对凝血和防止出血有一定意义。宫外孕Ⅱ号方可使血流量增加,血管舒张,对改善循环状况,促进散瘀有一定作用[38]。目前,我院根据多年临床研究总结出的一整套异位妊娠评分标准和治疗方案,通过中西医结合和多途径用药,取得良好的疗效[39]。
  一套治疗方案的规范化和优化——确诊为输卵管妊娠后,何时可以使用纯中药治疗,何时应该中西医结合治疗,何时应该果断地采取手术治疗方式,这是一项需要多中心临床验证的长期的循证医学任务。因此,只有临床研究的规范化设计、衡量、评价,才是不断优化和更新方案的最好支持。
  同时,对中医药治疗输卵管妊娠的基础研究也应该提到一个更被关注的高度,中医药起效的作用机制和作用途径,除了目前我们所熟知的血液流变学角度,也可以从细胞、亚细胞组织结构、分子基因水平上得以论治证。
  因此,本研究拟在前期临床研究的所确定的“输卵管妊娠中西医结合治疗方案”的基础上,在相同辨病分期、辨证分型及病情影响因子相同的条件下,按照单盲法、前瞻性的随机对照研究,建立西药对照组,对中西医结合治疗输卵管妊娠的有效性、科学性和可行性作出评价。
  并通过体外培养输卵管妊娠滋养细胞,用含有化瘀消癥杀胚复方成分的含药血清加入培养基,并设立甲氨喋呤含药血清及空白血清为对照组,验证中药对输卵管妊娠滋养细胞细胞凋亡及凋亡相关蛋白的影响。
  进而,从临床试验与实验研究的角度,探讨中医药对输卵管妊娠的治疗效果和作用机制。

第一章  文献研究

第一节  异位妊娠的临床研究进展

  异位妊娠已是妇科临床中的常见病和多发病,其结局严重影响女性的生殖健康。近年来其发病率有上升趋势,据资料统计,其发病率占所有已知怀孕总数的1%[1]以上。随着现代检测技术的进步和妇科医生对本病警惕性的提高,异位妊娠的早期诊断率已大大提高,临床所使用的多种非手术疗法治疗早期异位妊娠也达到一定的疗效,使部分患者避免了因手术而承受的痛苦,减少了术后并发症,同时最大限度保全了患者的生育能力。非手术疗法包括西药治疗,中西医结合治疗及中药治疗,常用药物有甲氨喋呤、米非司酮、中药复方、中成药等。但对中药药物治疗的作用机理研究目前多局限于血液流变学方面,尚处于初级阶段。

一、异位妊娠的中医药研究进展
(一)异位妊娠在古代文献中的描述
  中医古籍文献中没有异位妊娠的病名记载,但按其临床表现,散见于“妊娠腹痛”、“停经腹痛”、“少腹瘀血”、“经漏”、“妊娠下血”、“崩漏”及“癥瘕”等病名之中。如汉代张仲景在其《金匮要略?妇人妊娠病脉证并治第二十》中所谈到的“妇人有漏下者,有半产后因续下血都不绝者,有妊娠下血者,假令妊娠腹中痛,为胞阻”;宋代的《圣济总录?妇人血积气痛》中用没药丸“治妇人血气血积,坚僻血瘀,发竭攻刺疼痛,呕逆噎塞,迷闷及血蛊胀满,经水不行”;明代《普济方》“月水不行,腹为癥块”中用桂枝桃仁汤“治气郁乘血,经候顿然不行,脐腹酸痛,上攻心肋欲死。”这与输卵管妊娠破裂或流产时,多数患者出现的停经,突发下腹剧痛,晕厥,或伴恶心呕吐,以及腹腔内出血等症状和体征有相似之处。高少才认为与“异位妊娠”最符合也最精当的文献应该首推汉代张仲景所提的“漏下、半产后因续下血都不绝、妊娠下血、胞阻(妊娠腹中痛)”等四种妊娠病象(《金匮要略? 妇人妊娠病脉证并治第二十》[2]。

(二)中医病因病机
  中医学认为输卵管妊娠的发病机理与少腹宿有瘀滞,冲任胞脉、胞络不畅,或先天肾气不足,后天脾气受损有关。由于肝郁致气滞血瘀,或素有湿热阻滞致湿热瘀结胞脉;或先天肾气不足,冲任气血失调导致胞脉不畅或阻滞,运送孕卵受阻,不能移行至子宫;或由于脾肾气虚,不能把孕卵及时运送至子宫,而在输卵管内发育,以致破损脉络,阴血溢于少腹,发生血瘀、血虚、厥脱等一系列证候,其病机本质是少腹血瘀证[3]。

(三)中医辨证分型
  1981 年卫生部组织编写的《中国医学百科全书?中医妇科学》把“宫外孕”作为中西医通用的一个病名收入,1986年作为“妊娠腹痛”病的附篇编入全国高等医学院校《中医妇科学》[4]教材。该教材中“异位妊娠”病的辨证分期为“未破损期”和“已破损期”。其中,“已破损期”又辨证分为的“休克型”、“不稳定型”和“包块型”。自此之后,几乎所有版本《中医妇科学》统编教材都以此分期、分型为准。这种分型方法指出了输卵管妊娠不同时期的临床特征,但不能确切反应输卵管妊娠在不同阶段的中医病机特点。
  根据近年来的文献报道,学者们对输卵管妊娠的中医辨证分型提出了自己的看法,王津[5]临床上将异位妊娠分为未破损期、已破损期和后期。未破损期:输卵管妊娠尚未破损,腹痛隐隐发作,阴道淋漓流血,妇科内诊可触及一侧附件包块或弥漫性增厚,B超提示盆腔混合性肿物,未见液暗区;已破损期:输卵管妊娠发生流产,腹痛加剧,引肛门坠胀,阴道淋漓流血不断,妇科内诊阴道后穹窿及一侧附件包块有触痛,B超提示盆腔混合性肿物增大,伴有液性暗区;后期:β- HCG 降至正常后,盆腔包块未消失或有生育要求者,并按不同的辨证分型提出不同的治法。刘秀峰[6]将住院的异位妊娠病例分为湿热兼瘀型和血瘀气滞型进行治疗,并设立米非司酮西药对照组,结果提示两组疗效无显著统计学意义。
  导师邓高丕教授认为“异位妊娠”病的辨证分期应为“未破损期”和“已破损期”。“未破损期”的辨证分型为“胎元阻络型”与“胎瘀阻滞型”;“已破损期”的辨证分型为“气血亏脱型”、“正虚血瘀型”及“瘀结成癥型”[7];并初步建立输卵管妊娠的病情评分模型和输卵管妊娠辨病分期与辨证论治规律,归纳总结出“孕周、腹痛程度、β-HCG值、盆腔内出血量和输卵管妊娠包块(B超下)最大径等”5个因素为输卵管妊娠的主要病情影响因子。目前该治疗方案已经纳入国家中医药行业专项研究中,并编入现行的中医学教材之中[8-9]。

(四)中医治疗进展
1.中药汤剂治疗
(1)分型分期论治
  钟晓玲[10]将异位妊娠患者分为急性出血型和包块型,急性出血型以杀胚消癥,化瘀止血为法,方药:天花粉30g,蜈蚣3条,红藤、赤芍各15g,桃仁、炒蒲黄(包煎)、延胡索、枳壳各10g,三七粉3g(冲服);包块型采用化瘀消癥散结为法,用宫外孕II号方加减:丹参、赤芍各15g,三棱、莪术、桃仁、红花、茯苓、丹皮各10g;若瘀结成癥,腹中结块酌加夏枯草、穿山甲各15g,牡蛎30g;结果总有效率达90%。任亚娟[11]将异位妊娠患者分为不稳定型和稳定型;稳定型:血β-HCG 下降前或无活动性内出血前给予自拟杀胚止血方,药物组成为全蝎6g,蜈蚣3条,紫草根15g,天花粉10g,红藤20g,白及15g,槐花15g,炒蒲黄( 包煎) 15g,五灵脂15g,三七粉(冲服) 2g;稳定型:血β-HCG 下降>15%,且无活动性内出血,给予宫外孕II号方加减,药物组成为赤芍15g,丹参15g,桃仁10,归尾10g,血竭6g,元胡10g,生蒲黄(包煎) 15g,三棱10g,莪术10g,香附12g;并配合西药治疗,结果28例病例中治愈27例,总有效率为96.43%。
(2)基本方加减
  蔡文娟[12]报道应用基本方:金银花、丹参各24g,红藤30g,山慈菇、赤芍、夏枯草、路路通15g,莪术、穿山甲各10g,蜈蚣2条,随证加减,每日1剂,连续服用1-3个月。服药期间每隔3天复查一次血β-HCG,直至正常;每周复查1次B超,直至包块消失。治疗异位妊娠200例,复发3例,复发率仅为1.5%。赵龙[13]等应用中药(丹参15g,赤芍15g,桃仁15g,三棱15g,莪术15g,当归10g,乳香10g,没药10g,延胡索15g,天花粉15g,每日1剂水煎服,连服5天为1个疗程)治疗异位妊娠患者,并设立米非司酮及甲氨喋呤两个对照组,结果中药组治愈率为79.25%,甲氨喋呤组治愈率为80.39%,米非司酮组治愈率为78.57%,3组间差异无统计学意义( P>0.05),而中药治疗的毒副作用发生率明显低于西药治疗。

2.综合疗法
   综合疗法可以提高药物保守治疗异位妊娠的疗效,用药多以活血化瘀,消癥散结为法,用药途径包括外敷、灌肠、中成药口服及中药针剂等,均可作为辅助治疗的手段。
(1)外敷法:外敷药物能促进盆腔局部血液循环,改善组织营养状态,提高新陈代谢,利于炎症吸收和消退,对于异位妊娠疾病,可选择起活血化瘀、温经散寒、软坚散结作用的中药进行外敷,是常用的综合治疗手段之一。
张治琼[14]等报道,中药汤剂口服加中药外敷治疗异位妊娠患者,外敷方药用千年健60g,追地风60g,花椒60g,艾叶50g,五加皮60g,白芷60g,透骨草60g,羌活6g,独活60g,血竭60g,乳香60g,没药60g,共为细末,每250g 1份,敷下腹,红外线神灯照射30min,每日2次,总有效率达88.17%。吴菊香[15]等用中西医结合治疗非破裂型输卵管妊娠患者,并加用消癥散化裁热敷:千年健、追地风、艾叶、当归各300g,透骨草、乳香、没药各200g,丹参、虎杖、川芎、赤芍各240g,研末布包,每袋含原药100g,笼蒸热敷下腹部,结果其非手术成功率为88.89%。黄丽云[16] 等报道予中药内服的同时采用双柏散(含侧柏叶、黄柏、大黄、泽兰、薄荷等)冷敷下腹部,每日2次,每次4-6小时,观察30例,较单给予中药内服组28例效佳,痊愈率分别为96%、84%,有显著性差异(P<0.05)。
(2)中药针剂静脉注射:目前临床上用于治疗异位妊娠最常用的是丹参注射液。丹参注射液活血化瘀,现代药理表明其具有促进机体血液循环,扩张周围血管,改善外周血液分布,抗自由基损害,修复已受损的生物膜等作用[17],从而减低组织损伤,重建组织内环境稳定,促进内源性抗生物质,有助缓解血液循环障碍[18],具有抗炎、抗感染、镇痛作用[19]。
(3)中成药口服:中成药用药方便,疗效确切,现也常作为异位妊娠中医综合保守治疗的一种主要剂型。临床上常用的包括桂枝茯苓丸、血府逐瘀颗粒、大黄蟄虫丸等。桂枝茯苓丸出自《金匮要略?妇人妊娠病脉症并治篇》,具有活血化瘀,缓消癥结的作用;药理研究表明其能改善组织微循环,扩张血管,降低毛细血管通透性,对抗渗出性炎症及增生性炎症,抑制结缔组织增生,增强机体免疫力的作用[20]。血府逐瘀汤是清代王清任《医林改错》中治疗胸中血府血疲的经典方,全方配伍活血不耗血,祛瘀能生新;血小板聚集试验说明该方可明显降低血小板聚集率,具有改善微循环作用[21]。大黄蟄虫丸出自张仲景《金匮要略?血痹虚痨病脉证并治》,该方配伍独特,虫类药集中,药力峻猛,逐瘀之力甚猛,是祛瘀血、寓补干消、标本兼治之剂。
(4)保留灌肠:妇科疾患发病部位在盆腔下部,采用直肠给药,保留灌肠,局部直接给药,能够促进血液循环,较口服给药吸收快,同时可避免对胃肠的不良刺激,加快腹部包块的吸收。刘毓林[22]运用丹参15g,赤芍15g,桃仁9g,三棱6g,莪术6g,延胡索10g,香附10g,乳香10g,没药10g,银花12g,连翘12g,败酱草12g等药物保留灌肠,并配合中药汤剂口服治疗包块型异位妊娠患者,结果内服外治组总有效率与单纯内服中药组比较有显著性差异(P<0.05)。朱颖等[23]报道先后使用宫外孕I号方、宫外孕II号方加减并配合该院制剂中药清康灌肠液(组成:丹参,延胡索,金银花,败酱草,鸡血藤,蒲公英,丹皮,莪术,三棱等)100ml保留灌肠加离子透入治疗,每日1次,同时予米非司酮25mg口服,每日1次,治疗26例,成功率为92%。但对于保留灌肠治疗异位妊娠存在有不同的看法,有学者认为[24-25]认为,血HCG定量<1000IU/L,妊娠包块<3cm的异位妊娠患者可考虑用灌肠方法治疗,注意用药期间患者卧床休息,避免剧烈运动,尽可能减少增加腹压的因素;动态观察患者的生命征,定期复查血β-HCG定量和B超判断胚胎是否死亡。另有学者[26]认为,灌肠要在临床症状缓解,HCG转阴后才开始,此时胚胎滋养细胞活性消失,可避免由于灌肠而引起肠管蠕动牵拉导致输卵管妊娠破裂。

3.中医治疗的预后分析
  何成群[27]等报道,将例输卵管妊娠术后患者随机分为两组,治疗组于术后2周及术后2个月经周期行中医综合治疗3次,方案为盆炎散(白花蛇舌草30g,两面针30g,蒲公英30g,大黄30g,黄柏30g,赤芍30g,白芷15g)热敷下腹,配合盆炎灌肠液(毛冬青30g,大黄30g,白花蛇舌草30g,两面针30g,枳壳15g,丹参15g,三棱10g,莪术10g)保留灌肠;对照组仅术后常规抗感染治疗;结果应用中医综合治疗,其重复异位妊娠率为3%,宫内妊娠率为72.18%,对照组重复异位妊娠率为37.15%,宫内妊娠率为21.18%,对比差异明显(P<0.05),治疗组及对照组的不孕率为24.12% 、40.17%,差异明显(P<0.05)。吴涢婷[28]等将药物保守治疗成功后的异位妊娠患者分为治疗组和对照组,治疗组拟通络助孕方(当归,川芎,赤芍,皂角刺,丹参,路路通,王不留行,山茱萸,淫羊藿,菟丝子,续断等)治疗,对照组采取输卵管通液术,两组均治疗1个月为1个疗程,治疗3个疗程并随访2年观察再次妊娠情况,结果两组的有效率比较有显著性差异(P<0.05)。袁智民[29]等服自拟中药杀胚消癥汤(桃仁10g,三棱15g,莪术15g,桂枝10g,蜈蚣10g,水蛭10g,丹参12g,蒲公英25g,皂角刺15g,赤芍10g,甘草6g),与米非司酮共同治疗异位妊娠,并在血β-HCG 正常、盆腔包块消失、月经复潮干净后3-7天行治疗性输卵管通液术,第2个月经周期行输卵管碘油造影术,结果异位妊娠药物保守治疗成功率90.91% ,输卵管复通率85.71%。

(五)中药及复方研究进展
  最初开创异位妊娠药物治疗的是中医中药。1958年,山西医学院第一附属医院首先使用宫外孕Ⅰ号、Ⅱ号方保守治疗异位妊娠,并取得突破性进展。此后,各地医院在宫外孕Ⅰ号、Ⅱ号方的基础上,采用中医或中西医结合的方法保守治疗异位妊娠,取得了巨大进步。
异位妊娠的非手术治疗,成功率高低与药物能否杀死胚胎具有重大关系。在如何选择杀胚药物问题上,已作了不少探索,其中研究较多的有以下几味:
  紫草:紫草含有乙酰紫草醌、紫草醌等,有一定的抑制滋养细胞生长和分化的作用。李媛[30]用大剂量紫草配伍宫外孕Ⅱ号方治疗异位妊娠30例,总有效率96%。动物实验示紫草单味水煎剂喂养的大白鼠,子宫内膜呈退行性变,孕囊呈明显出血及大片坏死变性,隐见蜕膜样内膜,说明紫草具有影响滋养层细胞使孕囊变性坏死的作用。杨柳 [31] 等运用紫草乙醇提取物对体外培养人绒毛组织,发现其能显著抑制体外培养的人绒毛组织分泌HCG的功能,破坏绒毛组织结构,甚至使其坏死。
  天花粉:《本草纲目》记载治疗胞衣不下。现代药理研究表明,天花粉蛋白有致流产和抗早孕作用。其机理是:能选择性地使胎盘绒毛合体滋养细胞变性坏死,解体的细胞碎片留在血窦中,造成循环障碍和进一步大量组织坏死。胎盘绒毛损伤后, 孕激素下降至先兆流产水平以下。由于胎盘形态和功能的严重损伤,破坏了母体与胎儿之间的关系,造成流产。田德明[32]等报道,运用天花粉蛋白注射液保守治疗90例未破裂型异位妊娠患者,其中86例在一次注射后治愈,治愈率为91.1%;66例患者经MTX治疗后,有42例单次注射后治愈,治愈率为63.6%,两组疗效对比差异有显著性(P<0.01)。朱卫忠[33]等报道,对符合保守治疗条件的400例患者先行宫颈注射天花粉蛋白注射液2.4mg,注射后5天后所有病例均服用蜈粉杀胚汤,结果治愈378例,治愈率为94.5%。实验方面,商恩缘[34]等以体外无血清培养的人早孕绒毛细胞滋养层细胞为培养模型,测定天花粉蛋白对滋养层细胞HCG及孕酮分泌的影响,发现体外无血清培养的细胞滋养层细胞分泌的HCG在天花粉蛋白浓度为0.1μg/ml即下降50%,而后下降缓慢,8μg/ml以上方降为零,而随着天花粉蛋白浓度升高,孕酮分泌缓慢下降。
  宫外孕方中的中药[35]:①丹参,其有活血调经,凉血消痈的作用。现代药理发现其含脂溶性非醌类成分,具有抗凝、促进纤溶,抑制血小板聚集,抑制血栓形成的作用,此外还可增强机体免疫力。②桃仁,《本草经疏》云:“桃仁,性善破血,散而不收,泻而无补。”本品有抗凝及较弱的溶血作用,对血流阻滞、血行障碍有改善作用。③赤芍,《滇南本草》谓其有“降气,行血,破瘀,散血块,止腹痛”作用。现代药理发现其有抗血小板凝集,抗血栓形成作用。现代临床上常将上述中药灵活组方,收到良好效果。山西医学院第一附属医院使用的宫外孕Ⅰ号、Ⅱ号方便是以丹参、赤芍、桃仁以主药。许志芃 [36] 等用宫外孕II号方加味治疗异位妊娠,选择符合西医妇产科学第六版适合保守治疗的异位妊娠患者随机分成两组,观察组口服宫外孕II号方加味,对照组肌注MTX,结果两组总有效率及血β-HCG下降时间无明显差异(P>0.05)。许爽君等[37]运用宫外孕II号方加味治疗异位妊娠51例,治愈43例,无效8例,治愈率为84.31%;其中血β-HCG≤5000IU/L者45例中,治愈40例,治愈率为88.89%。
  吴银雪[38]认为:中药治疗宫外孕,主要是利用药物的杀胚作用及活血化瘀类药物,如丹参、赤芍、三棱、莪术等调动巨噬细胞吞噬功能的作用,以杀死胚胎,促进包块吸收。另据报道宫外孕Ⅰ号方(丹参、赤芍、桃仁)能促进纤维蛋白原在肝脏合成,降低血浆纤溶酶的溶解活性,抑制赖氨酰氧化酶活性,起到凝血和防止出血的作用,可用于破裂后仍有少量内出血或腹腔内血液未凝成血肿包块者。宫外孕Ⅱ号方(丹参、赤芍、桃仁、三棱、莪术)可提高血浆纤溶酶活性和血浆胶原酶活性,促进单核巨噬细胞机能,促进腹腔淋巴管对血浆蛋白的吸收,促使宫外孕包块尽快吸收消散,用于治疗未破裂型及破裂后无继续内出血,腹腔内血液已凝成血肿包块者。
  综上所述,中药治疗输卵管妊娠主要利用中药的化瘀消癥杀胚能调动巨噬细胞的吞噬作用改善血液循环,使病变局部血管扩张,增加血容量,改善组织缺氧状态,减少胶原纤维合成,提高腹膜通透性并促进胶原酶活性,提高纤溶酶活性,使机化组织变软,利于血肿与妊娠物的吸收的作用,可缩短治疗时间,提高治愈率,特别适合于迫切要求保留生育能力的早期输卵管妊娠患者。但目前的研究多处于血液流变学的水平。

(六)输卵管妊娠中西医结合治疗方案的制定和实施
  导师邓高丕教授带领的课题组,根据中医理论与临床实践,确立了新的输卵管妊娠的中医辨证分型,归纳总结为未破损期的胎元阻络、胎瘀阻滞与已破损期的气血亏脱、正虚血瘀和瘀结成癥五型。初步建立输卵管妊娠的病情评分模型和输卵管妊娠辨病分期与辨证论治规律,归纳总结出“孕周、腹痛程度、β-HCG值、盆腔内出血量和输卵管妊娠包块(B超下)最大径等”5个因素为输卵管妊娠的主要病情影响因子。通过回顾性与前瞻性研究,确立了输卵管妊娠的中西医结合治疗方案。从2004年1月开始,课题组应用总结出的输卵管妊娠辨病分期、辨证论治规律及其中西医结合治疗方案至今,临床治疗了1000多例输卵管妊娠的患者,其中药物治疗成功率达到88.9%以上,手术治疗成功率为100%[39]。使部分患者减少了因手术而造成的痛苦以及术中术后可能出现的并发症。并有效地指导临床医生根据输卵管妊娠的不同情况选择较佳的治疗方案,以达到理想的治疗效果,避免了治疗手段的太过或不及。目前该治疗方案已经纳入国家中医药行业专项研究中。

二、异位妊娠的西医药物保守治疗研究进展
  西药治疗异位妊娠,是期用药物破坏绒毛,杀死或抑制滋养细胞,使组织胚胎坏死、脱落、吸收和完全溶解,无管壁的损伤,既不破坏输卵管组织,又可保持其通畅,从而避免因手术造成的疤痕及周围组织的粘连。药物治疗的适应症有以下几点:无明显腹痛和活动性出血,血压、脉搏平稳;B超示输卵管妊娠包块最大直径不超过5cm,子宫直肠窝无或仅有少量积血;血β-HCG<6000 IU/L;肝肾功能正常,红细胞、白细胞、血小板计数正常。目前治疗异位妊娠的西药有甲氨喋呤(MTX)、米非司酮(RU486)、5-氟脲嘧啶(5-Fu)、前列腺素、氯化钾、高渗葡萄糖等,其中最常用的是前3种。

(一)甲氨喋呤(MTX)
  甲氨喋呤等细胞毒性药物用于治疗滋养层疾病如葡萄胎、绒毛膜癌已有30多年的历史。甲氨喋呤是一种叶酸拮抗剂,它通过与细胞内二氢叶酸还原酶的结合,阻断二氢叶酸转化为具有生物活性的四氢叶酸,导致嘌呤和嘧啶的合成被抑制,从而干扰DNA、RNA及蛋白质合成和胚胎滋养细胞分裂,以致胚胎死亡。
  甲氨喋呤的给药方法由早期的肌内注射或静脉滴注用药的全身给药法,发展为手术治疗时或腹腔镜下用于病变部位直接注射给药。随着超声技术的发展,可在阴道B超引导下经阴道直接注射到病变部位。对早期输卵管间质部妊娠和宫颈妊娠,药物治疗已成为首选治疗,局部高浓度给药可以提高疗效,不良反应低,为目前临床应用的主要方向。
  作为保守治疗的方法,多以肌肉注射为主。Barharnt[40]的Meta分析,比较MTX多次解毒方案和50mg/m2单次肌注成功率、副反应,认为多次用药比单次用药更有效(OR =1171;95%CI:1104-2182) 但副反应多一些(OR = 0144;95%CI:0131-0163);单次用药成功率低于多次解毒方案,但副反应明显减少。但最近Lipscomb[41]立足患者个体资料(patient individual data)另一Meta分析,却认为50mg/m2单次肌注成功率90%,并不低于多次解毒方案,而且副反应明显减少。国内方面,邱仙华[42]等报道,静脉推注一个疗程总量80mg,可20mg或40mg隔日静脉推注,次日可用甲酰四氢叶酸解毒,成功率为90%。目前静脉注射少用。肌肉注射可0.4mg/(kg?d),5天为一疗程,间隔一周可开始第二个疗程;或MTX单次肌注50mg/m2,用药4-7天后如血β-HCG下降<15%或继续升高,第7天给予同量药物肌注[43]。周平[44]对照MTX单次与多次保守治疗异位妊娠,单次方案为50mg/m2,单次肌注,最多不超过3个疗程;多次方案为MTX 1mg/kg 隔日肌注,第1,3,5,7天,同时使用CF以减少副作用,其用量为MTX 的1/10,即0.1mg /kg,隔日一次,第2,4,6,8天;结果发现单次给药与多次给药成功率无明显差异,但从两者用药后患者副反应表现来看,单次给药副反应要少。

(二)米非司酮(RU486)
  米非司酮是一种19-去甲睾酮的衍生物,具有抗糖皮质激素,抗孕激素和流产作用,在受体水平起效,其靶器官是子宫内膜(或蜕膜),特别是毛细血管内皮细胞,能取代体内孕酮,与孕激素受体形成复合体进而抑制孕激素与其受体结合,使体内孕酮水平下降,导致胎膜组织失去孕酮的支持,致使蜕膜发育不良,坏死,出血,引起蜕膜与绒毛膜分离,导致胚胎的死亡,这是目前公认的米非司酮终止妊娠的作用机制[45]。米非司酮在作用于蜕膜的同时也能达到下丘脑和垂体,引起黄体生成素(LH)浓度下降,从而继发黄体溶解。体外实验证明,米非司酮可直接作用于合体滋养层细胞,引起HCG、胎盘泌乳素和孕酮的下降[46]。杨亚洲[47]等报道米非司酮可使滋养细胞核固缩,胞浆稀少及空泡变,从而促进滋养细胞的凋亡。人体口服米非司酮后1.5 h的血药浓度可达0.8mg/L ,并立即到达孕酮的靶器官,其与孕酮受体的结合力比孕酮强6-8 倍,使孕酮丧失生物活性,从而达到撤退孕酮的临床效应[48]。

  早期异位妊娠的杀胚治疗正是利用了米非司酮能作用于受体水平的抗孕酮药物,它本身无雌激素、孕激素、雄激素的活性,与孕酮受体的亲和力比孕酮强5倍,能与内源性孕酮竞争结合受体,产生较强的抗孕酮作用,使妊娠黄体萎缩,引起蜕膜和绒毛变性,导致出血和HCG下降,阻止胚胎发育这一特点。但由于输卵管部位的血运远不如子宫,输卵管细胞中的孕激素受体(PR)远比子宫内膜与肌层中(PR)少,故必须加大剂量,局部组织才能达到治疗剂量。苏放明[49]研究认为只有较高浓度(总量2700mg)的米非司酮才能与体内的孕激素竞争输卵管上的PR,使输卵管妊娠病灶失去孕激素的支持发生坏死、吸收。使用米非司酮治疗一疗程结束后,病情稳定(HCG下降不显著,包块缩小不明显)可给予米非司酮第二疗程,以提高成功率。口服米非司酮剂量越大,绒毛蜕膜组织的病理变化越明显[50]。
  国外使用米非司酮治疗异位妊娠主要是与MTX联用,在MTX单剂量(50mg/m2)的基础上,加用米非司酮600mg单次口服,治愈率达96.7%[51],且两药联合治疗可以缩短治愈时间,要优于单独用药。近年来国内关于米非司酮治疗异位妊娠的报道较多,大多使用的方案是单用米非司酮总量300-600mg,分3-4天口服,治愈率达95%以上[52],但在病人的选择上一般为β-HCG水平较低、盆腔包块直径<5cm、无胎心搏动者。魏志红[53]报道,将异位妊娠患者随机分成治疗组和对照组,治疗组用米非司酮治疗,方案为100 mg/次,5日一个疗程;对照组用甲氨喋呤治疗,方案为20mg/次,肌注,5日一个疗程;结果治疗组成功率为88.3%,对照组成功率为71.7%,两组比较差异具有统计意义(P<0.05),不良反应方面两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

(三)5-氟脲嘧啶(5-FU)
  5-氟尿嘧啶也是对滋养细胞极为敏感的化疗药物,在人体内将转变成5-氟尿嘧啶脱氧核苷,抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶,阻止尿嘧啶脱氧核苷甲基转变为胸腺嘧啶脱氧核苷,从而干扰DNA合成,使滋养细胞死亡。由于妊娠早期滋养细胞增生活跃,因此,应用5-FU治疗宫外孕可使绒毛变性、坏死,达到杀胚胎的作用。皮青灵[54]等回顾性分析两种不同保守治疗异位妊娠的治疗方法,5-FU组予5-FU静脉滴注,方案为10 mg/kg/日,静脉注射4h-6h滴完,6-8天为一疗程,结果有效率81.58%;MTX组予MTX 50mg/m2单次肌肉注射,结果有效率89.06%,两者差异无显著性(P>0.05)。兰鹰[55]对40例用5-FU保守治疗的患者行子宫输卵管造影发现其通畅率为82.4%。

(四)其他药物
  前列腺素、氯化钾、高渗葡萄糖等大多采用局部用药,一般效果较肯定,但使用不方便,近年来随着MTX及Ru486在临床上的广泛使用已不常用于异位妊娠的治疗。

第二节  滋养细胞体外培养及复方中药含药血清的研究进展

一、人绒毛组织滋养层细胞体外培养概况
  滋养层细胞大约在受精第4天出现,为一层扁平细胞构成的细胞壁。胚泡植入子宫壁后,滋养细胞沿两条途径分裂增殖,并可沿绒毛和绒毛外两个方向分化,最终形成生物学特性明显不同的绒毛细胞滋养细胞(villous cytotrophoblasts,VCT)和绒毛外滋养细胞(extravillous cytotrophoblasts,EVCT)[56]。VCT位于绒毛的内层,其有丝分裂活跃,形成新滋养细胞;新滋养细胞膜消失则融合成绒毛外层的合体滋养细胞(syncutiotrophoblast,ST)。EVCT具有侵袭能力,向子宫间质和螺旋动脉腔内侵袭性生长,使受精卵锚定并植入,并形成固定绒毛(anchoring villus)。
  生理妊娠时,充分的细胞滋养层细胞(cytotrophoblast,CT )侵入子宫壁层并且重铸母体-子宫血管网络是建立子宫胎盘血液循环的关键。妊娠早期,胚胎发育时在一个相对缺氧的环境下进行,其后随着滋养层细胞的不断侵入,胎盘供养改善,母胎物质交换得以完善。
人类绒毛组织滋养层细胞是一种妊娠相关细胞,在胚胎植入、母胎免疫耐受过程中发挥重要作用。人类绒毛滋养层细胞体外培养用于妇产科、生殖医学、分于生物学等多种研究领域,可避开用人体实验进行研究所带来的伦理学问题。查阅国内外资料,目前以培养妊娠早期胎盘绒毛滋养细胞最为多见,因为此时滋养细胞活力强,易生长,取材方便。根据文献报道,近年来,绒毛滋养细胞培养的培养技术、分离纯化及鉴定方法也已较为成熟。
输卵管妊娠部位的绒毛滋养层细胞,同样具备具有内分泌功能的合体滋养细胞和具有侵袭活性的绒毛外滋养细胞[57-58]。故参照培养早期宫内妊娠的绒毛滋养层细胞培养的方法,体外分离培养输卵管妊娠部位的绒毛组织滋养层细胞是一种创新性的尝试,也是输卵管妊娠基础研究中的重要环节。

(一)培养方法
  现有的原代滋养细胞培养方法不外乎组织块法和酶消化法。组织块法简单易行,成功率高,细胞可成活并生长,缺点是原代细胞生长周期长,所获得的细胞数量少,生长缓慢,约需20天左右,且容易混杂成纤维细胞、蜕膜细胞等细胞[59]。该法一个明显的缺陷是不能在短时间内获得大量可供实验研究用的细胞。
  而酶消化法尽管各研究者采取的步骤、试剂各异,但这些方法的基础都是用胰酶消化、分离细胞,再配合应用其他试剂,如胶原酶、DNA酶、EDTA等。此法可以很快获得大量活细胞,细胞在短时间内生长成片,原代细胞产率高,但步骤繁琐、易污染,而且胰酶,尤其是胰酶的质量不同,消化条件较难统一,消化过程和离心过程均对细胞有不同程度的损伤。吴霞[60]等应用不同的胰酶消化条件,在同一次实验中用较短的时间获取相当数量的绒毛滋养层细胞和绒毛外细胞滋养层细胞。王云[61]等通过实验对两种方法进行计较,组织贴块法细胞生长过程中由于组织块中残留有利于细胞生长的因子,故细胞生长较容易,但细胞纯度会受影响,需在以后的传代中关注细胞纯化问题;酶消化法在细胞生长时不似前者容易,消化时间、消化时温度及酶浓度均应很好地加以控制,且首次细胞成活时间较组织块法时间延长,但其细胞纯度在初次接种时相对要高。

(二)分离纯化
  早孕绒毛组织中主要含有两种成分,分别是滋养层细胞和间质细胞,如何排除间质细胞等其他细胞成分而保留所需的细胞成分是绒毛膜滋养层成功培养的关键。滋养层细胞的纯化可采用不同的方法,其纯化的程度从40%至90%不等,根据实验研究和临床诊断目的不同对细胞纯度的要求也有差别。较早用于纯化胰蛋白酶消化分离的单细胞悬液的方法是BSA密度梯度法,其后有人采用Percoll密度梯度法,但Percoll密度梯度液的配置过程较为繁琐[62]。Ugele B[63]等采用Percoll不连续密度梯度法,分离纯化的细胞滋养层细胞纯度可达90%以上。Huppertz B[64]和Hirano T[65]等则用CD9免疫亲和层析法纯化滋养层细胞,但由于成本等原因,此方法运用并不多见。亦有研究者运用磁珠分离方法[66],得到的滋养层细胞纯度较高,可达98%以上,但该方法相对复杂,技术要求较高,分离结果的稳定性和重复性不够好,试剂的价格昂贵。
近年来,国内学者也报道了一些滋养细胞分离纯化的方法。王雪萍[67]利用成纤维细胞和上皮细胞对胰蛋白酶耐受性不同的特点,采用系统差别消化方法纯化绒毛膜滋养层细胞,效果理想,简便可行。龚洵[68]等利用滋养层细胞及成纤维细胞均为贴壁细胞,但滋养层细胞在接种后2小时开始贴壁,而成纤维细胞等杂细胞先于2小时贴壁的特点[69],应用反复差速贴壁法纯化滋养细胞。此方法早已运用于肿瘤及其它一些细胞的原代培养,避免了细胞贴壁变形后再标记去除的繁琐及污染风险[70]。陈莉娟 [71] 等则利用成纤维细胞和早孕期滋养层细胞表达的膜分子不同的特点,采用流式细胞仪分选获得高表达HLA-G的人早孕绒毛膜滋养层细胞,经分选后,其纯度可达98.0%。刘杰[72]等运用淋巴细胞分层液进行纯化,并联合在传代过程中倒掉先脱落的部分间质细胞的方法,分离纯度达90%。白菡 [73]等调整了Percoll的浓度,选择密度为1.040g/ml的30%浓度和密度为1.080g/ml的60%浓度的Percoll细胞分离液分离和纯化滋养层细胞,结果在两个梯度之间形成了很好的细胞带,鉴定结果滋养细胞可占94%以上。王云[61]等报道在传代时首先选取DMEM低糖培养基作细胞培养,因其对成纤维细胞的生长有一定的抑制作用,继而用Ficoll分离及差速贴壁法进行纯化,传3代后细胞纯度可达95%。

(三)培养条件
1.培养基
  Lobo[74]等曾比较了有血清与无血清,M199、DMEM高糖型与低糖型培养基的差别;Daniels[75]等比较了无血清与在F12中培养的差别并提出在培养液中加入生长因子如EDF可促进细胞生长,培养皿/瓶用细胞外基质如FN(fibronectin)处理可促进细胞贴壁,细胞滋养细胞适于生长在D-valine培养液中,而L-valine可使成纤维细胞过度生长。王海燕[76]等报道,用鼠尾胶包被培养器/皿,采用低浓度胰酶一次性消化法获得绒毛外滋养层细胞,具有高度增殖活性和侵袭能力;采用高浓度胰酶,长时间连续消化法分离得到绒毛滋养层细胞,具有高度融合、分泌β-HCG的合体滋养层细胞特性。白菡[73]观察到鼠尾胶原对滋养层细胞贴壁的影响较大,经过胶原处理的培养表面细胞贴壁数量明显增加,细胞活力好,分裂增殖旺盛,而未经处理者细胞贴壁能力差。有研究报道[77],绒毛外滋养细胞只有种植在包被有Matrigel的培养板上才可存活,在普通塑料板上不易贴壁,而绒毛细胞滋养细胞则可粘附于塑料培养板上。Matrigel Basement Membrane Matrix是从小鼠肉瘤中提取的可溶性基底膜抽提物,主要成分为laminin,还有胶原IV、entactin、硫酸肝素糖蛋白及一些生长因子[78]。李幼飞[79]等认为,初次接种时培养基不能过多,只需常规用量的一半,有利于减少液体浮力的影响,使细胞和小组织块充分与瓶壁接触,贴壁机会增大。

2.pH值
  培养基的pH值是影响细胞生长的重要原因之一[80],不同的细胞对pH值的最适应值和允许波动范围不同。黄莉[81]等认为,在培养接种前,预先将培养基放入CO2培养箱平衡2h,使培养基的pH值平衡达到绒毛膜细胞所需的pH值,由于不加Hepas,减少培养基在CO2箱中因时间长而产生毒素减少对细胞的损伤;在接种后,放入CO2培养箱是半开放式培养,可保持pH值的稳定。施琼[82]等比较了不同pH值的培养基和接种不同时间的细胞贴壁率,发现滋养细胞在pH为6.8和7.0的培养基中贴壁率很高,细胞生长良好,从而得出滋养细胞生长培养基的最佳pH值为6.8-7.0。龚洵[68]等报道,人早孕绒毛滋养层细胞体外培养的pH值为7.0-7.2。

3.氧分压
  从受精卵植入到分娩,胎盘部位的氧浓度都在变化,氧浓度的生理性变化是胎盘发育的必要条件。研究表明[83],妊娠早期氧分压变化与滋养细胞浸润活性的变化密切相关。另有研究发现低氧可以刺激滋养细胞使其进入有丝分裂,保持增生状态[84]。黄玲玲[85]等将体外培养的滋养细胞分为正常组:37℃、5% CO2培养箱培养;缺氧对照组:细胞在37℃,含2%氧气,5% CO2、93% N2的培养箱中培养,分别培养1、4、12、36、48、72h,结果发现缺氧1、4、48h后可导致滋养细胞增殖活力增强,说明滋养层细胞可在缺氧条件下存活,缺氧可导致细胞活力明显增强;而后期缺氧细胞的增殖活力与正常氧下滋养细胞相比无区别。

4.接种的密度
  组织细胞之间有着动态的功能和营养上的联系,若组织块密度过低,不利于生长、增殖和存活;过密不仅营养差,而且细胞代谢废物积聚过多,培养液迅速酸化,致使细胞发生酸中毒,抑制细胞增殖[86]。Mekenzie[87]等认为选用的细胞密度为1×106个细胞/ml最好。陈晓[88]等认为,接种的组织块尽量剪碎,一般剪碎至1mm3为宜,接种的浓度以5块/cm2为宜。

(四)细胞鉴定
1.光镜观察细胞形态
  Kliman[89]和Lysiak[90]等通过光镜观察细胞的形态为多边形,相差显微镜下可见人绒毛膜滋养层细胞附壁,细胞体积大,呈圆形。胞浆丰富,核大椭圆形,可见少量含多核的合体滋养叶细胞。HE染色光镜下可见绒毛膜滋养层细胞呈圆形或椭圆形,胞浆呈淡红色,核为浅紫色。透射电镜下滋养层细胞外布满微绒毛,胞质中线粒体大而多,游离核糖体和多聚核蛋白体丰富,高尔基复合体明显。粗面内质网与线粒体相贴近。胞质中还可见到电子密度较高的脂滴、膜包颗粒和髓样小体。核较大,核内异染色质少而分散,染色浅。

2.细胞骨架
  鉴定滋养层细胞细胞骨架的方法主要有两种:流式细胞术和免疫细胞化学法。流式细胞术是目前最客观、最有效地确定滋养层细胞纯度、活性和多样性的方法,但由于成本太高,应用并不广泛。免疫细胞化学法,即采用抗滋养层细胞特异性分子标志的抗体与细胞结合,再用酶标记的二抗识别,显色剂显色,根据细胞的阳性率确定细胞的纯度。采用抗细胞角蛋白抗体和抗细胞波形蛋白抗体对分离纯化的细胞滋养层细胞进行鉴定,是目前应用较为广泛的方法[67]。因为角蛋白(CK)是构成上皮细胞特异性的细胞骨架蛋白,而滋养层细胞是人胚胎绒毛组织中唯一的上皮样组织,故滋养细胞表现为抗角蛋白阳性;但不同类型的细胞角蛋白和广谱的细胞角蛋白并不具备有滋养层细胞的特异性[91],在绒毛轴心、间质细胞中也有表达,所以单纯采用抗角蛋白鉴定的方法,仍有假阳性高的可能。波形蛋白(vimentin)是内皮细胞及间质细胞的标志蛋白,故波形蛋白在间质细胞中表达阳性,而在滋养层细胞中表达阴性,借此可将滋养层细胞和间质细胞区分开来。
  Blaschitz[91]等报道,在被监测的13个抗角蛋白抗体中,仅CK-7抗体对滋养细胞是特异性的。Frank[92]研究小组也发现,在人胎盘子宫间质细胞中,CK-7对于滋养细胞的特异性是最强的,推荐用于滋养细胞鉴定,建议CK-7阳性少于50%的细胞不可用于研究。
张磊[93]等采用直接免疫荧光双标记染色检测细胞中用FITC标记的角蛋白(CK18)和Cy3标记的波形蛋白,发现细胞胞浆中有绿色荧光(FITC)的CK18表达,无红色荧光(Cy3)的波形蛋白表达,以此来鉴定滋养细胞。

3.细胞活力检测(台盼蓝排斥试验)
  制备单个细胞悬液,作适当稀释(106/ml)后取9滴细胞悬液移入小试管中,加1滴0.4%台盼蓝溶液,混匀,镜下观察,死细胞被染成淡蓝色,而活细胞拒染,在3分钟内用血球计数板分别计数活细胞和死细胞数。根据下列公式计算出细胞活力:活细胞率(%)=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100%。

二、复方中药体外培养细胞的可行性和优势
  关于动物或人服用药物后血液中产生与药物因素有关的成分目前还没有明确的定义,有学者将其称为“血中的移行成分[94]”,亦有学者将其称为“血中药源性成分[95]”,包括药物原型成分及其代谢产物,也包括药物因素诱导体内产生的内源性成分。有学者认为,采用含药血清培养细胞可直接观察中药的药物学特性,便于应用细胞学和分子生物学手段,从基因、基因产物、药物受体和酶诸方面阐述药理机制;使现代科学和传统医学有一个可行的切入点,有利于应用现代生命科学技术和手段揭示中药复方配伍的实质;便于追踪和观察药物吸收和代谢的过程,以便较为清楚地认识复方药物中主要药物的有效成分及活性部位,为进一步开发新药提供依据[96]。
  用临床上行之有效的复方中药体外培养细胞,是用体外模拟代谢后药物有效成分直接作用于靶点的方式,探讨复方中药起效的作用机理。体外培养输卵管妊娠部位滋养层细胞,可为输卵管妊娠部位组织滋养层细胞的生物学特性,以及进一步揭示输卵管妊娠发病机制及药物作用机理的实验室研究,提供有价值的细胞模型。

(一)中药复方制剂的制备
  制备用于细胞培养的中药复方制剂要求较高。以蒸馏水煎煮后,有直接采用水煎液,但更多采用水煎醇沉淀提取液,过滤、浓缩、调节pH,并经微孔滤膜或高温除菌,最终制成中药原液[97]。

(二)含药血清的制备
1.给药剂量
  血清药理学很重要的一个问题是给药剂量的确定,合适的给药剂量,对保证实验的成功非常关键。给药剂量目前尚无统一标准。因含药血清进入反应体系后,浓度被稀释,使反应体系的浓度达不到在体条件的药物浓度。王力倩[98]等发现,以参考公式:给药剂量=临床常用量×动物等效面积系数×培养基内血清稀释度,计算给药剂量,得到的含药血清对肿瘤细胞体外生长有抑制作用,而比上述参考公式计算的给药量小1倍量的含药血清无明显作用。王宁生[99]认为,给药剂量以整体模型动物的有效剂量8-18倍为宜。

2.给药次数及时间间隔
  给药时间上,目前常用的方法有:1次给药,或间隔2-4小时给药,或每日1-3次,连续3-10天。王宁生[99]认为,根据药动学理论,固定给药时间间隔,相同剂量多次反复给药后,血浆药物浓度达到稳态浓度,并将在此浓度下不同采血时间的含药血清进行实验,均表现较高且相似的药理作用强度。中药复方制剂的有效化合物含量较低,作用广泛而缓和,可调节机体多系统功能,起效相对较慢,故临床用药时间相对较长。尽管已有研究表明,连续给药5天和10天所制备的含药血清的生物学效应是相似的[100],但无论哪种给药方法都必须使药物浓度达到相对平衡状态。关键在于两个方面:一是基于目前中药复方多为临床验方,制备含药血清时必须紧密结合临床实践以及考虑实验的可操作性;二是药物在血清中的积蓄浓度必须达到或接近药物均值。每日1次,连续3天给药后采血的方式可反映药效产生的时间点,突出含药血清本身的作用,基本排除正常血清对实验结果的干扰,优于单次给药[101]。中药复方药物动力学研究也提示反复多次给药,其血药浓度具有持续性。徐海波[102]等认为,按药物半衰期间隔给药,连续5-7个半衰期使血药浓度处于稳定状态后,再采血制备含药血清比较科学。由于中药及其复方成分复杂,半衰期难以测定,他认为采用7-10天给药法是权宜之计。目前国内很多学者提出每天给药3次,连续7天的给药法,认为与临床用药情况相合,同时蓄积的血药浓度已近均值。

3.采血时间
  采血时间上,较理想的采血时间应在血药浓度的高峰期。蒙一纯[103]等认为,根据实验动物消化生理特点和中药吸收、生物转化特点确定采血时间范围是十分合理的。如大鼠一般1-2小时可达血药浓度峰值,此时血清即为含药血清;时间延长将有部分药物成分发生转化,成为药物代谢血清。李仪奎[104]等在对大量的中药药物代谢动力学参数进行分析之后,提出一种通行的方案,即每天给药2次,连续3天,末次给药后1小时采血,称为“通法”。梁春敏[105]等应用中药血清药理学方法,观察玉屏风散对小鼠免疫功能的影响实验表明:30分钟-2小时时相的试验血清均能促进小鼠脾淋巴细胞增殖(P<0.10或P<0.05),1小时时相血清作用最强,在时效关系曲线上表现为峰值。李仪奎[106]分析了96种药物的达峰浓度时间,发现小于1小时的42个,1-2小时的46个,大于2小时的8个,多数药物达峰浓度的时间为1-2小时,故采血时间以给药后1-2小时为宜。大鼠一般1-2小时可达到血药浓度峰值,符合大鼠药物入血的生理特点[107]。

4.含药血清的预处理及保存
  空白血清中存在许多体内有的激素、酶、抗体、补体等自体活性物质,若含药血清不灭活,它们可能对体外反应系产生影响而干扰实验结果[108]。目前血清预处理有三种方法:丙酮法,向血清中加入4-5倍量丙酮,混匀,于3000r/min离心,取上清液温水浴上蒸发,除去丙酮;乙醇法,向血清内加入4-5倍95%乙醇,混匀,于3000r/min离心,取上清液温水浴上蒸发,除去乙醇;加温法:56℃水浴上放置30min。这三种方法主要去除了血清中的大部分蛋白质、糖及部分电解质,血清的正常生物活性基本丧失,容易突出血清中中药的作用。李仪奎[106]等提出当空白血清出现显著的阳性反应或者当进行离体器官实验,血清量加入太多,通氧时形成大量泡沫,都会严重妨碍实验进行,因此需要灭活血清,从而降低或清除空白血清的干扰作用。可见,灭活血清对某些研究指标是需要的。但仍有学者认为[109],若含药血清灭活,则药物本身某些活性成分可刺激机体产生的激素、酶、抗体等活性物质,与药物结合的血浆蛋白一并被除去,从而也可能影响实验结果。周芝兰[110]等比较了运用乙醇、丙酮、甲壳素及加热几种常用的含药血清预处理方法后发现,丙酮预处理过的药物血清既方便,又能降低血清中存在的抗His及抗Ach活性成分,使实验顺利进行;且用经丙酮预处理过的小青龙汤含药血清对离体豚鼠气管张力影响进行了观察,初步说明经丙酮预处理后,药物活性并没有一并被除去,证明丙酮预处理血清的可行性。
  对含药血清的保存,周明眉[111]等通过含药血清抑制血小板释放5-HT和阻滞内皮细胞钙离子通道流量两项实验研究发现,含药血清经长时间低温保存(-20℃,2个月)后药效显著降低(P<0.01),提示低温冰冻保存影响含药血清药效。崔晓兰[112]等证实3天保存或不保存处理的比较,对药效无任何影响。所以应选用新鲜或保存时间较短的含药血清进行实验。

5.含药血清的添加量
  有关血清添加量方面,一般方法多采用含药血清与常规培养血清并存。由于培养液中包含较丰富的营养物质以及含药血清的细胞毒作用,在离体实验中,含药血清的浓度不宜过高。目前中药含药血清的浓度还没有确切的规定,选用5%、10%、20%浓度的含药血清进行实验的说法不一。周明眉[111]等发现含头风饮的血清与富含血小板血浆的比例为1/4时,其抗血小板释放5-HT作用最强。吴健宇[113]等在研究补阳还五汤保护氧自由基损伤的血管内皮细胞时发现10%的血清添加量既能成功地制造出血管内皮细胞受损模型,又能产生明显的药理效应。聂咏梅[114]等在四逆汤抗氧化应激性损伤保护心肌细胞机制中研究发现,15%四逆汤含药血清的DMEM培养基是心肌细胞生长的合适浓度。但总的来说,进行细胞增殖抑制作用的实验采用高浓度的效果好,而进行细胞增殖促进作用的实验采用低浓度的效果好[100]。
  中药血清药理学通过有效组分在血液中的动态变化、相互作用及药效的相互关系来反应复方的配伍原则和药物的量效关系,在一定程度上揭示了中药的生物转化过程,为复方中药的研究奠定了基础。当然,中药血清药理学仍存在不足之处,包括动物选择、给药方案、采血时间以及血清预处理等。尽管如此,中药血清药理学能真实反映中药与机体之间的相互作用,故在很大程度上排除了中药直接离体实验具有的不确定因素干扰,增加了实验结果的科学性。

第三节  细胞凋亡对妊娠相关疾病影响的研究进展

  细胞凋亡(apoptosis,Apo)又称细胞程序性死亡(programmed cell death,PCD),是指细胞在一定生理或病理条件下,遵循自身的程序,通过自我调控结束自己生命的过程[116]。Apo是一个主动的、高度有序的、基因控制的、一系列酶参与的过程。它被认为是维持机体内环境稳定,清楚衰老和无能细胞的重要机制[117]。

一、细胞凋亡的形态学特征
(一)凋亡的起始[118]:细胞表面的特化结构如微绒毛消失,细胞间接触消失,但细胞膜依然完整;线粒体大体完整,但核糖体逐渐从内质网上脱离,内质网囊腔膨胀,并逐渐与质膜融合;染色质固缩,形成新月形帽状结构等形态,沿着核膜分布。

(二)凋亡小体的形成[118]:核染色质断裂为大小不等的片段,与某些细胞器如线粒体一起聚集,为反折的细胞质膜所包围。细胞表面产生了许多泡状或芽状突起,逐渐形成单个的凋亡小体。凋亡小体逐渐为邻近的细胞吞噬并消化。

二、细胞凋亡的生化特征
(一)主要表现为DNA片段化[118]:核小体中的组蛋白与DNA的连结键断裂,内源性核酸内切酶被激活,有控制的特异地将DNA降解为180-200bp整数倍大小的若干条经琼脂糖凝胶电泳呈特征性梯状条带图谱。

(二)其他生化改变[118]:
1.胞浆Ca2+水平:与细胞凋亡的关系密切,实验证明,凋亡的发生伴随胞浆Ca2+的升高。
2.胞浆H离子浓度 细胞凋亡伴随胞浆PH下降。
3.线粒体凋亡时,呼吸链受损,ATP合成下降,膜电位下降,膜通透性增加。
4.细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻膜磷脂的不对称性分布改变,凋亡时PS由质膜内侧翻向外侧。

三、细胞凋亡的调节
(一)受体介导的细胞凋亡[118]
  细胞通过细胞膜表面的受体接受周围环境传来的生长信号,维持正常的生长和分裂,一旦细胞失去来自环境的支持生长的信号,将自发启动细胞内的凋亡程序,进入细胞凋亡的过程。
TNF、Fas和TRAIL等配体与细胞质膜表面的死亡受体结合,促使受体聚集而形成三聚体。受体聚合后通过C端的死亡结构域DD募集链接蛋白FADD,随后通过FADD的死亡效应功能域(DED)富集procaspase-8或者procaspase-10,在细胞质膜内侧形成受体/凋亡调节分子复合物,从而引起procaspase-8的自身活化。活化的caspase-8又引发下游分子caspase-3或caspase-7的切割和活化。在某些情况下,死亡受体也能募集TRADD,参与DISC复合物形成。在某些情况下,细胞内有足够的caspase-8被激活,从而直接导致细胞凋亡的快速发生。在多数情况下,死亡受体介导的caspase-8活化需借助线粒体凋亡通路来放大。死亡受体激活的caspase-8能切割细胞浆中的Bid,切割的Bid向线粒体转移,从而诱导细胞色素C释放和细胞凋亡。tBid转移至线粒体,能与抑制凋亡的Bcl-2家族蛋白如Bcl-xL,Mcl-1等相互作用,释放出与抑凋亡分子相互作用的分子,如Bak等,从而促进细胞色素C释放和细胞凋亡。

(二)Bcl-2家族与细胞凋亡的调节[118]
  Bcl-2家族蛋白在凋亡调控中起关键作用,被称为细胞凋亡调节监测点(Apoptosis Chece-poirt)分子,它们在细胞凋亡的信号整合和调节中起关键作用。
抑制凋亡的Bcl-2家族蛋白分子,如Bcl-2,Bcl-xL等大多数存在于线粒体和其他细胞器膜上,其作用类似于受体。而作为促进细胞凋亡的Bcl-2家族蛋白分子,如Bax,Bid等,大多存在于细胞浆中。在凋亡因子刺激下,促凋亡蛋白分子发生转录水平上的增加(如p53介导的Bax,Noxa,Puma等)和翻译后的修饰而被激活,其作用相当于凋亡配体。促凋亡分子配体如Bax,Bid等转移至线粒体,与线粒体膜上的受体分子如Bcl-2,Bcl-xL等相互作用,从而调节线粒体细胞色素C和其他凋亡因子的释放。

(三)线粒体与细胞凋亡[118]
  线粒体被广泛认为是细胞的能量工厂,它提供真核细胞代谢所需要的能量,最新研究表明,线粒体还是细胞凋亡的调控中心。线粒体可形象地被比喻为细胞凋亡信号的中继站。当细胞受到凋亡刺激后,线粒体接受凋亡信号,加以整合,然后通过释放凋亡相关物质,对凋亡信号进行放大。凋亡的信号被激活后作用于线粒体,诱发线粒体释放细胞凋亡因子如细胞色素C,Smac,AIF等。这些分子可激活caspases依赖或者caspase非依赖的细胞凋亡机制,引起细胞凋亡。线粒体本身不仅能整合细胞凋亡信号,还可作为细胞凋亡的放大器,在凋亡过程中释放大量自由基。核酸酶和蛋白酶,由此作为细胞凋亡的直接执行者。
  线粒体膜上存在巨大的孔道结构,称为线粒体通透性转换孔(permeability transition pore,PTP),PTP能够实现受控的开放和关闭。已有证据表明此复合体横跨线粒体内外膜,其中包括细胞质中的蛋白(己糖激酶)、外膜蛋白(电压门空通道 VDAC)、内膜蛋白(腺苷酸转运蛋白ANT)和线粒体基质蛋白cyclophilin D等组分。在凋亡过程中,PTP与Bax等结合,在线粒体外膜可以形成足够大的通道,使细胞色素C等促凋亡物质能从外膜释放。细胞凋亡是一个主动的需能过程,需要ATP的供应。

四、凋亡调控蛋白Bcl-2及Bax
  Bcl-2属原癌基因,是80年代从人的滤泡性B细胞淋巴瘤中分离出来,故称Bcl-2(B-cell lymphoma leukemia-2)。其位于人第l8号染色体短臂,mRNA长约6kb,编码产物位于线粒体内膜、核膜和内质网膜上。不同亚细胞定位的Bcl-2在不同的细胞凋亡信号途径中发挥作用。线粒体膜上的Bcl-2通过控制线粒体的膜电位、调节线粒体膜的通透性等过程来抑制凋亡。电镜研究显示,Bcl-2不是随机地在核膜中分布,而是在与核微孔复合物相连,可能在核的运输、核微孔复合物的形成和核膜的维持方面起重要作用。研究发现Bcl-2促进GSH进入核内,改变核内的氧化还原反应,阻止caspase蛋白酶的活动和其他核改变,抑制细胞凋亡。定位于内质网膜上的Bcl-2通过阻止Ca2+从内质网向胞质中的流动而抑制凋亡[119] ;Bcl-2通过抑制活性氧ROS的产生或拮抗ROS的作用而抑制细胞凋亡[120] ,Bcl-2可通过多条途径来抑制凋亡。
  促凋亡蛋白Bax(Bcl-associated protein x),其分子大小为21kDa,由192个氨基酸组成,与Bcl-2的氨基酸序列有21%同源性。实验证明Bax被钙蛋白酶裂解成18kD后比21kD的Bax更具有诱导凋亡的能力[121] 。凋亡发生时,Bax从胞质中转移到线粒体膜上,并且形成一个通道,诱导细胞色素C从线粒体中释放出来[122]。Bcl-2通过抑制Bax插入线粒体膜或直接、间接地抑制Bax通道的活性来阻止细胞色素C的释放[123],来调控细胞的凋亡。

五、细胞凋亡在不同植入部位妊娠的研究进展
  细胞凋亡(apoptosis)凋亡参与机体细胞生长与更新的调节,与正常妊娠和病理妊娠有密切关系。Bcl-2是抗凋亡蛋白,能抑制细胞凋亡,而Bax则能促进细胞凋亡的发生,Bcl-2/Bax之间的比例平衡决定着凋亡的发生[124]。在细胞内Bcl-2蛋白可与Bax蛋白形成异二聚体,Bcl-2/Bax比值决定细胞致病信号刺激后存活与否起关键作用[125]。Sharifah [126]等认为细胞凋亡的变化出现在Bcl-2/Bax这对拮抗蛋白的比例变化中。凋亡及凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax在不同植入部位的表达与滋养层细胞的侵袭和蜕膜化等都有一定的关系。
(一)细胞凋亡与宫内妊娠早孕期中的研究
  近年来,细胞凋亡在妊娠中的作用日益受到重视,越来越多的研究表明,正常妊娠过程中,胎盘、蜕膜的凋亡和增殖处于一个平衡状态,一旦发生异常凋亡,平衡状态被打破就可能导致病理妊娠的发生。早孕期引起自然流产的因素诸多,染色体的异常、母体因素、免疫因素等均可通过对凋亡调控基因的影响,诱发异常细胞凋亡,导致自然流产的发生[127]。Kokawa[128]研究了胚胎绒毛蜕膜细胞凋亡的情况,发现正常妊娠和自然流产的绒毛蜕膜中都有细胞凋亡的出现,但程度有所不同,自然流产中,细胞凋亡明显活跃,细胞凋亡在人早孕初期散在于蜕膜组织中。研究结果表明,自然流产中过度的蜕膜组织凋亡可能是妊娠终止的原因。另有研究亦发现,不明原因的复发性自然流产患者,其滋养层细胞凋亡增多[129]。丁峰[130]等研究认为Bcl-2/Bax蛋白共同参与正常早孕期蜕膜细胞凋亡的调节,任何打破这一机制者,均能影响妊娠的继续,可能导致妊娠的失败。

(二)细胞凋亡与输卵管妊娠研究概况
  Kokawa[131]等用特别的生物技术发现,孕早期凋亡在绒毛组织和蜕膜中,发生在一部分特别类型的细胞中,异位妊娠的细胞凋亡发生在绒毛膜比正常宫内妊娠明显,而异位妊娠中蜕膜细胞的凋亡则比较少见。Rangoa [57] 等也发现,不像正常宫内妊娠,凋亡在输卵管妊娠中经常发生在绒毛膜而不是在底蜕膜中。
  Rangoa[57]等发现孕期开始3个月输卵管妊娠中细胞凋亡数量比宫内孕中下降,滋养细胞有潜在的侵袭活性和自我凋亡能力,而在输卵管妊娠中由于不同植入部位使母体微环境不同,外周绒毛滋养层细胞的旁分泌影响因素可能缺乏,结果凋亡的引导失败,引起外周绒毛滋养层细胞的无控制侵袭。
  Kocera[58]等发现异位妊娠以合体滋养层中细胞凋亡占多数,在早孕阶段,孕卵的着床部位影响凋亡发生。凋亡调节中,Bcl-2是其抑制蛋白,起着保护细胞免于凋亡的作用,免疫组化发现输卵管妊娠破裂型阳性的Bcl-2染色带及强度较高,提示Bcl-2作为输卵管妊娠破裂时的一种新的免疫组化标记。Bcl-2可以作为破裂型输卵管妊娠的指标,大量的蜕膜层的细胞凋亡可导致自然流产,那么,可以推测出在异位的输卵管黏膜层的滋养细胞的侵袭,最终导致输卵管管壁的破裂出血,也可能是由于凋亡的调节失衡引起,比如抗凋亡蛋白的大量存在,导致不加控制的滋养层细胞的存活和增殖。所以认为Bcl-2表达量的升高反映了输卵管滋养层细胞的无限制增殖,可以把Bcl-2作为破裂型输卵管妊娠的一个新指标。

第二章  临床研究 
——输卵管妊娠中西医结合治疗方案的临床对照试验研究

一、研究内容和目的
  对2009年1月至2010年12月的输卵管妊娠病例进行辨病分期、辨证分型和计算病情影响因子总积分后,确定可以进行药物保守治疗的病例,按单盲法、不等随机对照试验,将病例分为观察组和对照组。观察组按照“输卵管妊娠中西医结合治疗方案”治疗,对照组用纯西药治疗。
  通过临床资料的搜集、对比和统计分析,对输卵管妊娠中西医结合治疗方案的有效性和安全性作出评价。

二、研究对象
(一)病例来源
2009年1月至2010年12月于广州中医药大学第一附属医院妇科住院,符合药物保守治疗的输卵管妊娠患者。

(二)病例选择
1.诊断标准(辨病标准)
(1)有停经史(个别无明显停经史),下腹疼痛(小部分可无下腹疼痛),或有不规则阴道流血。
(2)妇科检查:子宫常大或略大,一侧附件或可触及包块,有压痛。
(3)β-HCG阳性。
(4)盆腔B超:宫内未见孕囊,宫旁出现液性或混合性回声区,或该区有胚芽或原始心管搏动;或宫旁回声区无输卵管妊娠声像特征,但腹腔内存在无回声暗区或直肠子宫陷凹处有积液。
(5)不伴有腹腔移动性浊音或休克。
(6)诊断性刮宫及病检未见绒毛。

2.纳入标准
(1)符合诊断标准(1)-(4)。
(2)参考诊断标准(5)-(6)。
(3)签署根据病程不同阶段选用不同治疗方案的治疗同意书(药物保守治疗知情同意书见附录:附表1)。

3.研究对象的入选标准
  根据“输卵管妊娠辨病分期和辨证分型标准”对符合纳入标准的输卵管妊娠患者进行辨病分期和辨证分型,并根据“输卵管妊娠病情影响因子积分法”对纳入病例进行评分,根据“输卵管妊娠中西医结合治疗方案”确定治疗方案,选择适合纯中药治疗或符合中西医结合治疗的病例,分为两大组作为研究对象进行临床观察。
(1)输卵管妊娠辨病分期和辨证分型标准(该标准已通过广东省科技成果鉴定):
  1)辨病分期:主要是根据输卵管妊娠是否已发生破裂、流产分为未破损期和已破损期。辨病分期的要点:
<1>符合以下情况者列为未破损期(输卵管妊娠未发生破裂或流产):
① 多有停经史,无明显下腹疼痛,或伴有阴道不规则流血。
② 妇科检查,子宫略大,一侧附件区或可触及包块。
③ β-HCG阳性或阴性。
④ 盆腔B超:宫内未见孕囊,宫旁出现轮廓不清的液性或混合性回声区,或该区有胚芽或原始心管搏动。
<2>符合以下情况者列为已破损期(输卵管妊娠已发生破裂或流产):
① 多有停经史,曾突发一侧下腹剧烈疼痛,或有反复明显的下腹疼痛,可伴有阴道不规则流血,或伴有晕厥或休克。
② 妇科检查:阴道后穹隆或饱满,子宫颈有举摆痛,子宫或有漂浮感,一侧附件区可触及到边界不清的包块,压痛明显。
③ β-HCG阳性或阴性。
④阴道后穹隆穿刺或腹腔穿刺,或可抽到不凝血。
⑤ 盆腔B超:宫内未见孕囊,盆腔内存在无回声暗区或边界欠清的混合性包块或子宫直肠窝有积液。
2)辨证分型:
<1>未破损期:辨证分为两型。
①胎元阻络型:或有不规则阴道流血或下腹隐痛,β-HCG阳性,或经B超证实为输卵管妊娠,但未发生输卵管妊娠破裂或流产。舌暗苔薄,脉弦滑。
②胎瘀阻滞型:胎元(包括胚胎和滋养细胞活性)已死亡,但未发生输卵管破裂或流产,腹痛减轻或消失,可有小腹坠胀不适,B超证实输卵管有局限性包块。β-HCG曾经阳性,现转为阴性。舌质暗,脉弦细或涩。
<2>已破损期:辨证分为三型。
①气血亏脱型:多有停经,或不规则阴道流血,突发下腹剧痛,面色苍白,冷汗淋漓,四肢厥冷,烦躁不安,甚或昏厥,血压明显下降,β-HCG阳性,后穹隆穿刺、或腹腔穿刺、或B超提示有腹腔内出血。舌淡苔白,脉细微。
②正虚血瘀型:输卵管妊娠发生破裂或流产不久,腹痛拒按,或有不规则阴道流血,头晕神疲。妇检或B超检查盆腔一侧有混合性包块。β-HCG阳性。舌质暗,脉细弦。
③瘀结成癥型:输卵管发生破裂或流产已久,腹痛减轻或消失,小腹坠胀不适,妇检或B超检查盆腔一侧有局限的混合性包块。β-HCG曾经阳性,现转为阴性。舌质暗,脉弦细或涩。
3)对研究病例按输卵管妊娠的病情影响因子评分模型进行评分(表1)。

注:该病情影响因子评分模型是根据文献研究和我们前期868例回顾性和前瞻性研究的结果制定。
4)对研究病例按输卵管妊娠的中西医结合治疗方案总表确定治疗方案。
(综合诊断、辨病分期、辨证分型、病情影响因子总积分和疾病发展的不同阶段,选择不同的治疗方案。表2)

注:①在前期共868例的临床研究中,按上述治疗方案,药物治疗的最低有效率达88.9%。手术治疗的治愈率为100%。
②本研究中的未破损期胎瘀阻滞型和已破损期瘀结成癥型,因β-HCG已转阴性,根据前期研究的结果,此时用西药杀胚(或杀灭滋养细胞活性)已无作用,因而不需设西药对照组,故本研究未将其纳入。
③根据前期研究的结果,手术治疗也不设对照组,故本研究未将其纳入。

4.排除标准
(1)不符合诊断标准和纳入标准者。                                                             
(2)严重心肝肾功能不全或有血液系统疾患者。
(3)输卵管妊娠合并宫内妊娠者。
(4)非输卵管性的异位妊娠。
(5)患者不同意,无法按方案进行治疗者。
(6)β-HCG阴性(滋养叶细胞已无活性)的输卵管妊娠患者。
(7)输卵管妊娠需手术治疗者。

5.终止和撤出临床试验的标准
(1)在试验期间出现严重毒副反应者。
(2)在试验期间出现其他疾病,影响试验进行者。
(3)在试验中不按要求治疗,自动退出者。

(三)分组方法
  采用分层随机化方法进行分组,以未破损期和已破损期的疾病分期为分层因素,层内再采用区组随机方法分配两组患者,考虑患者都是有中医药治疗要求,故采用不等的随机化对照,按计算器的随机数字键得出2:1的随机序列。符合药物保守治疗的试验分组表见表3(每个入组病例均填写病例报告表,见附录:附表2)。

三、研究方法
(一)研究设计方法
采用前瞻性,单盲,不等随机对照研究。

(二)干预措施
1.中医治疗:即中-观察组。
(1)中医基础治疗:以活血化瘀,杀胚止痛为治法。
①宫外孕Ⅰ号方(丹参15g、赤芍15g、桃仁15g),每日1剂,再煎,日服两次。
②散结镇痛胶囊,4粒,口服,一日三次。
③双柏散(侧柏叶、黄柏、大黄、薄荷、泽兰)100克,外敷下腹患侧,一日一次。
④丹参注射液,20ml,静脉滴注,一日一次。
(2)中医辨证分型治疗:
①胎元阻络型:在基础治疗上加强活血化瘀杀胚。可在宫外孕Ⅰ号方中选加蜈蚣(去头足)3条,紫草15g,天花粉20g,田七10g,或根据个体情况酌情加减。
②正虚血瘀型:在中医基础治疗上加强益气养血,化瘀杀胚。可在宫外孕Ⅰ号方中选加党参15g,黄芪20g,鸡血藤30g,田七10g,蜈蚣(去头足)3条,紫草15g,天花粉20g,或根据个体情况酌情加减。

2.中西医结合治疗:即中西-观察组。
(1)中医基础治疗及中医辨证分型治疗:同上1.。
(2)西药治疗选用米非司酮150mg口服,每日一次,连服5天。

3.西药治疗:即中-对照组,中西-对照组。
    上述两组均采用随机西药对照治疗,选用米非司酮150mg口服,每日一次,连服5天。

(三)疗程
治疗疗程以4周为上限。

(四)主要检测指标
1.入院后,及时检查妇科B超、血β-HCG定量。

2.观察治疗过程中:每周检查2次血β-HCG定量,每周检查1次妇科B超。

3.入院后检查血常规及肝肾功能1次;治疗结束时复查血常规及肝肾功能1次。

(五)药物治疗的疗效标准
1.近期治愈:阴道流血停止,腹痛消失;妇科B超检查妊娠包块缩小1/2以上;β-HCG测定连续两次阴性。

2.有效:阴道流血停止,腹痛消失;妇科B超检查妊娠包块缩小不到1/2或无增大;β-HCG测定连续两次阴性。

3.无效:腹痛加剧或伴失血性休克;妇科B超检查妊娠包块增大;β-HCG持续阳性且有增高趋势;中医治疗者需加用西药杀胚,西药治疗需加MTX肌注,或药物(中药或西药)治疗者改行手术治疗。

(六)安全性指标
观察服药后输卵管妊娠病例新出现的症状和体征(如皮疹、发热、腹泻、恶心、食欲不振等)。入院后检查血常规及肝肾功能1次;治疗结束时复查血常规及肝肾功能1次。

(七)统计方法
用SPSS15.0统计软件。计量资料先进行正态性检验和方差齐性检验,满足要求这两样本均数比较用t检验,未满足要求者两样本均数比较用秩和检验;计数资料用χ2检验。

四、结果
(一)一般资料
1.病例入选与临床试验完成情况 
根据诊断标准、纳入标准及排除标准,2009年1月至2010年12月共收集符合药物保守治疗的输卵管妊娠患者195例,其中符合纯中药治疗的126例,符合中西医结合治疗的69例。
(1)符合纯中药治疗的126例病例,按不等的随机对照方法分为两组。
观察组84例,其中2例要求直接手术而撤出试验,故实际完成病例数为82例,以下简称中-观察组。
对照组42例,其中3例要求直接手术,2例要求加中药治疗而撤出试验,故实际完成病例数为37例,以下简称中-对照组。
(2)符合中西医结合治疗的69例病例中,按不等的随机对照方法分为两组。
观察组46例,其中1例要求直接手术而撤出试验,故实际完成病例数为45例,以下简称中西-观察组。
对照组23例,其中2例要求直接手术,1例要求加中药治疗而撤出试验,故实际完成病例数为20例,以下简称中西-对照组。
输卵管妊娠药物保守治疗研究对象的完成情况见表4,图1。

2.年龄情况
(1)所有入组病例年龄分布情况
符合药物保守治疗的184例输卵管妊娠病例中,25-29岁年龄段所占比例最高,占37.5%;其次是30-34岁年龄段,占26.63%;18-24岁年龄段占21.20%;大于35岁年龄段占14.67%。(见表5,图2)

(2)符合纯中药治疗的两组年龄比较(见表6)

(3)符合中西医结合治疗的两组年龄比较(见表7)

4.腹痛情况
符合药物保守治疗的184例输卵管妊娠病例中,症状表现为隐痛占49.46%,表现为无痛占43.48%,表现为剧痛占7.07%。(见表11,图4)

5.B超下包块最大径
(1)所有入组病例B超下包块最大径情况
符合药物保守治疗的184例输卵管妊娠病例中,B超下包块最大径小于3cm者占73.37%,包块最大径在3-5cm之间的占23.91%,包块最大径大于5cm者占2.72%。(见表12,图5)

(2)符合纯中药治疗的两组B超下包块最大径比较(见表13)

(3)符合中西医结合治疗的两组B超下包块最大径比较(见表14)

6.B超下出血最大径
(1)所有入组病例B超下包块最大径情况
符合药物保守治疗的184例输卵管妊娠病例中,B超下出血最大径小于3cm者占76.63%,出血最大径在3-6cm之间的占23.37%,出血最大径大于6cm者占0%。(见表15,图6)

(2)符合纯中药治疗的两组B超下出血最大径比较(见表16)

(3)符合中西医结合治疗的两组B超下出血最大径比较(见表17)

7.初始血β-HCG值
(1)所有入组病例初始血β-HCG值情况
符合药物保守治疗的184例输卵管妊娠病例中,初始血β-HCG值小于1000IU/L者占71.2%,初始血β-HCG值在1000-3000IU/L之间者占23.37%,初始血β-HCG值大于3000IU/L者占5.43%。(见表18,图7)

(2)符合纯中药治疗的两组初始血β-HCG值比较(见表19)

(3)符合中西医结合治疗的两组初始血β-HCG值比较(见表20)

(2)符合中西医结合治疗的两组病情影响因子啊总积分比较(见表22)

9.小结
使用t检验(t-Test),分别从表6、7,表9、10,表13、14,表16、17,表19、20,表21、22中可见,符合纯中药保守治疗及中西医结合治疗的观察组和对照组,在年龄、停经时间、B超下包块最大径、B超下出血最大径、初始血β-HCG值和病情影响因子总积分比较,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。
(二)临床疗效研究结果
1.有效率
(1)符合纯中药保守治疗两组的有效率比较
符合纯中药保守治疗的119例输卵管妊娠病例中,观察组82例,有效率为81.71%;对照组37例,有效率为64.86%。两组比较见表23,图8。

(2)符合中西医结合治疗两组的有效率比较
符合中西医结合保守治疗的65例输卵管妊娠病例中,观察组45例,有效率为68.89%;对照组20例,有效率为60%。两组比较见表24,图9。

2.有效病例实际用药时间比较
(1)符合纯中药保守治疗两组,有效病例实际用药时间比较
符合纯中药保守治疗的119例输卵管妊娠病例中,观察组82例,有效67例,实际用药时间为10.76±5.92天;对照组37例,有效24例,实际用药时间为11.25±4.14天。两组比较见表25。

(2)符合中西医结合保守治疗两组,有效病例实际用药时间比较
符合中西医结合保守治疗的65例输卵管妊娠病例中,观察组45例,有效31例,实际用药时间为16.03±5.60天;对照组20例,有效12例,实际用药时间为13.17±4.73天。两组比较见表26。

3.有效病例血β-HCG值下降至50%及10%时间比较
(1)符合纯中药保守治疗两组,有效病例血β-HCG值下降至50%及10%时间比较
符合纯中药保守治疗的119例输卵管妊娠病例中,观察组82例,有效67例,血β-HCG值下降至50%的时间为4.66±2.07天,下降至10%的时间为9.28±3.40天;对照组37例,有效24例,血β-HCG值下降至50%的时间为5.58±3.19天,下降至10%的时间为11.17±4.99天。两组比较见表27。

(2)符合中西医结合保守治疗两组,有效病例血β-HCG值下降至50%及10%时间比较
符合中西医结合保守治疗的65例输卵管妊娠病例中,观察组45例,有效31例,血β-HCG值下降至50%的时间为5.87±2.88天,下降至10%的时间为12.52±4.19天;对照组20例,有效12例,血β-HCG值下降至50%的时间为6.00±2.66天,下降至10%的时间为12.50±4.52天。两组比较见表28。

(三)药物的安全性评价
1.两组病例治疗前后血常规与肝肾功能变化
(1)符合纯中药保守治疗的119例输卵管妊娠病例中,其服药前后血常规中的白细胞、血小板及肝肾功能均在正常值范围内变化。
(2)符合中西医结合保守治疗的65例输卵管妊娠病例中,观察组转氨酶升高1例,对照组肝肾功能未见明显异常。

2.不良反应 
(1)符合纯中药保守治疗的119例输卵管妊娠病例中,其中观察组82例,中药外敷后出现皮肤瘙痒2例,服药后出现胃肠反应1例,不良反应发生率为3.66%。对照组37例,出现胃肠反应1例,眩晕、乏力感2例,不良反应发生率为8.11%。所有不良反应症状均能在对症处理和停药后消失。
(2)符合中西医结合保守治疗的65例输卵管妊娠病例中,其中观察组45例,中药外敷后出现皮肤瘙痒1例,眩晕、乏力感1例,不良反应发生率为4.44%。对照组20例,出现胃肠反应1例,不良反应发生率为5%。所有不良反应症状均能在对症处理和停药后消失。

五、讨论
(一)纯中药保守治疗输卵管妊娠的方药解析
1.常用的治疗输卵管妊娠的单味中药分析
丹参:苦,微寒。归心、肝经。具有祛瘀止痛,活血通络,清心除烦之功效。《本草汇言》:“丹参,善治血分,去滞生新,调经顺脉之药也……补血生血,功过归、地,调血敛血,力堪芍药,逐瘀生新,性倍芎劳,妇人诸病,不论胎前产后,皆可常用。”现代药理研究发现丹参能提高纤溶酶活性;延长出、凝血时间;抑制血小板聚集(提高血小板内cAMP水平抑制TXA2合成);改善血液流变学特性(血粘度降低、红细胞电泳时间缩短),改善微循环。
赤芍:苦、微寒。归肝经。具有清热凉血,散瘀止痛之功效。《别录》论:“通顺血脉,缓中,散恶血,逐贼血,去水气,利膀胱大小肠,消痈肿,时行寒热,中恶腹痛,腰痛。”《药性论》论:“治肺邪气,腹中疞痛,血气积聚,通宣脏腑壅气,治邪痛败血,主时疾骨热,强五脏,补肾气,治心腹坚胀,妇人血闭不通,消瘀血,能蚀脓。”现代药理研究发现其能扩张冠状动脉、增加冠脉血流量;赤芍水提液、赤芍苷、赤芍成份及其衍生物有抑制血小板聚集作用;其水煎剂能延长体外血栓形成时间,减轻血栓干重;所含芍药苷有镇静、抗炎止痛作用;芍药流浸膏、芍药苷有抗惊厥作用;赤芍、芍药苷有解痉作用;赤芍对肝细胞DNA的合成有明显的增强作用,对多种病原微生物有较强的抑制作用。
桃仁:味苦、甘,苦以泄滞血而去血中之热,甘以生新血;性平。归心、肝、大肠经。具有活血祛瘀,润肠通便,止咳平喘之功效。《本草经硫》:“夫血者阴也,有形者也,周流夫一身者也,一有凝滞则为癥瘕,瘀血血闭,或妇人月水不通,或击扑损伤积血,及心下宿血坚痛,皆从足厥阴受病,以其为藏血之脏也。桃核仁苦能泄滞,辛能散结,甘温通行而缓肝,故主如上等证也。”现代药理研究发现桃仁提取液能明显增加脑血流量,增加犬股动脉的血流量,降低血管阻力,改善血流动力学状况。提取物能改善动物的肝脏表面微循环,并促进胆汁分泌。桃仁可使小鼠的出血及凝血时间明显延长,煎剂对体外血栓有抑制作用,水煎液有纤维促进作用。桃仁中含45%的脂肪油可润滑肠道,利于排便。桃仁能促进初产妇子宫收缩及出血。水煎剂及提取物有镇痛、抗炎、抗菌、抗过敏作用。
天花粉:甘、微苦酸,微寒,酸能生津,故能止渴润枯,微苦降火,甘不伤胃。归肺、胃经。具有清热生津,消肿排脓之功效。《本草纲目》记载治胞衣不下。天花粉蛋白止孕的作用机制是:天花粉蛋白进入体内直接作用于胎盘绒毛合体滋养叶细胞,造成其功能和形态的损伤,进而使循环障碍和进一步的大量组织坏死,胎盘激素水平迅速下降到先兆流产的临界水平以下。由于胎盘形态和功能严重损伤的结果,破坏了母体与胎儿间的内分泌联系和物质交换,使胎儿死亡。临床上证明:前列腺素F2a(PGF2a)有刺激宫缩引起流产的作用,在导致宫缩娩出胎体的过程中,天花粉蛋白的作用与促进前列腺素的合成和释放有关,天花粉可使妊娠大鼠子宫内PGE2、PGF2a 含量增高。关于天花粉蛋白致流产机理,多数学者认为,天花粉蛋白对绒毛滋养层细胞有选择作用,能使绒毛广泛变性坏死,纤维素沉着,绒毛间隙闭塞及阻断血循环,血循环被阻断又加速绒毛的变性坏死,促使前列腺素释放而引起流产[132]。闻明进行了天花粉蛋白肌肉注射治疗未破裂型异位妊娠的临床研究[133],发现39例患者中,36例经1次肌肉注射天花粉蛋白即可治愈,治愈率达92.3%;另3例患者经2次肌肉注射后也可治愈。
紫草:性寒,味甘、咸。归心、肝经。具有凉血,活血,解毒透疹的功效。《本草经疏》:“紫草为凉血之要药,故主心腹邪热之气。五疸者,湿热在脾胃所成,去湿除热利窍,其疸自愈。邪热在内,能损中气,邪热散即能补中益气矣。苦寒性滑,故利九窍而通利水道也。腹肿胀满痛者,湿热瘀滞于脾胃,则中焦受邪而为是病,湿热解而从小便出,则前证自除也。”现代药理研究发现紫草水提取物能使胎盘的绒毛细胞大量坏死,对黄体则无影响;对妊娠子宫具有兴奋作用;紫草提取物有抗小鼠着床作用;动物实验发现,长期服用紫草提取物,能使垂体、卵巢和子宫的重量下降,但对组织无损害, 其抑制作用是可逆的[134]。法韫玉 [135] 等将600例停经42d内的早孕妇女分两组,分别应用米非司酮联合紫草配伍米索前列醇及米非司酮配伍米索前列醇进行药物流产,结果表明米非司酮联合紫草组的完全流产率明显高于米非司酮组;前者孕囊排出时间较后者明显缩短,孕囊排出率升高,且出血时间和出血时间超过10d的发生率亦较后者明显缩短和减少。后证实从紫草根中分离得到的酚类化合物rabdosiin二钾盐具有显著的抗生育活性[136]。王丽君[137-138]等发现紫草总酚酸其能显著提高米非司酮对大鼠及小鼠的妊娠抑制率(P<0.05),增加实验组平均死胎数,且显著增强早孕小鼠离体子宫平滑肌条的收缩活性(P<0.01)。
蜈蚣:辛,温;有毒。归肝经。具有熄风镇痉,功毒散结,通络止痛的功效。蜈蚣的药用,始见于《神农本草经》。《别录》云:“疗心腹寒热结聚,堕胎,去恶血。”现代药理研究表明蜈蚣纤溶酶具有抗血栓作用[139]。吴红斌[140]运用蜈蚣降绒汤保守治疗异位妊娠患者,其有效率达93.5%。
田七:味甘微苦,性温,归肝、胃经。具有止血化瘀、消肿止痛的功效。《本草纲目新编》记载:“三七根,止血之神药也。无论上、中、下之血,凡有外越者,一味独用亦效,加入于补气补血药中则更神。盖此药得补而无沸腾之患,补红得此而有安静之休也。”《本草纲目》云:“三七止血,散血,定痛。”《玉揪药解》云:“三七和营止血,通脉行瘀,行瘀血而敛新血。”现代药理研究发现田七能够缩短出血和凝血时间,具有抗血小板聚集及溶栓作用;能够促进多功能造血干细胞的增殖,具有造血作用。

2.辨证论治及配伍优势
宫外孕I号方中丹参、赤芍、桃仁活血化瘀,理气止痛,加田七化瘀止血。中医认为,活血化瘀药物的药理作用甚为广泛,有止痛止血、疏通经络、破瘀散结、抗炎消肿、祛瘀生新等主要作用。现代研究证实大部分活血化瘀药有扩张血管,解除血管痉挛,降低血流量,改善局部微循环,抑制PLT聚集,对血凝块的分解、吸收有一定作用,故可阻止血肿包块的形成,对已形成的包块又能促进吸收消散[141]。配合天花粉使合体滋养细胞和细胞滋养细胞变性坏死,使HCG下降而不能继续妊娠;蜈蚣除了杀胚作用,消癥散结力也很强。故本研究在治疗胎元阻络型则采用宫外孕Ⅰ号方加天花粉、紫草、蜈蚣、田七,为中医治疗的基础方,以收活血化瘀杀胚之功。
正虚血瘀型乃因胎元异位,气血失常,胞脉破损,伤及正气,瘀血内阻的病机特点,故不仅要活血化瘀,杀胚止痛,更要扶正固本,益气养血,防止气血亏脱的发生。故此证型的基本方在上方基础上加用黄芪、党参、鸡血藤。黄芪味甘,气微温,气薄而味浓,可升可降,阳中之阳也,功专补气;党参味甘微酸,性平,鼓舞清阳,振动中气,而无刚燥之弊;两者合用固护中气,益气防脱。鸡血藤祛瘀血,生新血,活血补血不伤正。

(二)输卵管妊娠病情影响因子
1.年龄
从表5,图2可以看出,符合药物保守治疗的184例输卵管妊娠病例中,25-29岁年龄段所占比例最高,占37.5%;其次是30-34岁年龄段,占26.63%;18-24岁年龄段占21.20%。
25-34岁,正是女性最佳的生育年龄,也是生理性性活跃期。近年来,随着社会的开放和多元化发展,婚前性行为增多,性伴侣不稳定,缺乏性生活及避孕知识,导致流产、引产次数增加。术后又得不到良好的休息和疗养,或自行堕胎等引起盆腔感染。多种因素导致生殖道感染的发生率大大增加,而生殖道感染是异位妊娠最常见的病因。
从中医理论的角度分析此机理,生育期妇女房劳多产(含人工流产,屡孕屡堕),伤及肾气,正气本虚;经行产后,胞门未闭,风寒湿热、虫毒之邪内侵,与冲任气血相搏结,蕴积于胞宫,反复进退,耗伤气血,易成盆腔炎症。盆腔炎症导致盆腔胞脉胞络不畅,瘀血内阻,使胎元运行受阻而异位;胎元侵蚀血络使血络破损,络伤血溢,血不循经则成瘀。
18-24岁年龄段也占了21.20%的比例。近年来,异位妊娠患者发病年龄呈年轻化趋势。18-24岁之间多为中学生或大学生,正处于身体发育、心理转变的关键时期,是生命的特殊阶段。不安全的性行为,将直接影响到生育时期的生殖健康和心理健康。
因此,应加强宣传正确的婚育观念,加强避孕措施的宣传,避免不必要和过多的流产和引产,从而降低异位妊娠的发生率。

2.停经天数
从表8,图3可以看出,符合药物保守治疗的184例输卵管妊娠病例中,停经天数为43-56天所占比例最高,达52.72%;其次是停经天数为21-42天,所占比例为26.09%;停经天数为57天以上者占21.20%。
异位妊娠在停经56天,即8周之内被发现占大部分病例,乃因随着性卫生知识的宣教和人们对自身健康的重视程度升高,以及B超和血β-HCG等检测手段的灵敏性和普及化,使异位妊娠被早期发现和监测的可行性越来越高,同时也决定了药物保守治疗的可行性和治愈率越来越高。
停经天数反映了胚胎着床时间的长短、滋养细胞数目的多少及对输卵管的破坏程度,对于停经天数少的患者,理论上药物保守治疗成功率相对较高。但胚胎种植的部位及胚胎活性强弱是决定破裂早晚的主要原因:如输卵管峡部妊娠时,因该部位管径狭小,多在妊娠6周左右破裂;壶腹部妊娠时,因该处管腔较大,可至妊娠8周左右方发生破裂;间质部妊娠时,由于其周围子宫角肌层较厚,血供丰富,妊娠往往持续至3-4个月才发生破裂[142]。
停经天数应该被视为综合评价的指标之一。当然,作为临床医生,也应该对有停经史或不规则阴道出血史的患者高度重视,及早结合B超、血β- HCG定量等辅助检查,提高异位妊娠的早期诊断率,从而提高异位妊娠药物保守治疗的成功率。
3.腹痛程度
从表11,图4可以看出,符合药物保守治疗的184例输卵管妊娠病例中,症状表现为隐痛占49.46%,表现为无痛占43.48%,表现为剧痛占7.07%。剧痛一般伴随着气血亏脱的征象,治疗当予行手术治疗抢救生命为先。符合药物保守治疗的病例,所出现的剧痛症状,一般表现为一过性的剧痛,后能缓解。
腹痛,从传统的角度,是输卵管妊娠患者的主要症状,是患者就医的一个重要的原因,缘于胚胎在输卵管内逐渐增大,常表现为一侧下腹部隐痛或酸胀感[142]。但由于腹痛属于患者的自觉症状,与每个个体疼痛感知程度和耐受程度也有很大的关系,且随着B超和血β-HCG等检测手段的灵敏性和普及化,一部分患者可在疾病的较早期即被发现,不一定表现出腹痛的症状。故无痛及隐痛者占药物保守治疗患者的绝大部分,且两者比例相当。

4.B超下出血量最大径
从表12,图5可以看出,符合药物保守治疗的184例输卵管妊娠病例中,B超下包块最大径小于3cm者占73.37%,包块最大径在3-5cm之间的占23.91%,包块最大径大于5cm者占2.72%。
超声不仅能对异位妊娠作出及时准确的诊断,而且能估测出血量,动态观察出血情况,为病人选择最佳治疗时机和方案提供可靠依据。若输卵管妊娠发生流产或破裂,则盆腔出血量多,且从B超检测下出血量最大径呈急速上升趋势,则患者可明显感到下腹部疼痛,肛门坠胀感,甚至恶心、呕吐;体征方面可有宫颈举摆痛及后穹窿穿刺抽出不凝血等急需手术抢救生命的表现[142]。
所以,在符合药物保守治疗的输卵管妊娠病例之中,一般而言,B超下出血最大径不会很大,积分不会很高。但值得提出的是,超声检查结果只描述的是当前的状态,出血较少者,多见于胚胎全部完整的剥离流入腹腔,发生完全流产;继续出血者,多见于异位妊娠不全流产,滋养叶细胞仍可存活相当长一段时间,继续侵蚀输卵管组织,引起反复出血[143,144]。
故临床医生应根据超声提示的出血量,结合患者的病情变化,综合估计出血量,为患者选择最佳的治疗方案。

5. B超下包块最大径
从表15,图6可以看出,符合药物保守治疗的184例输卵管妊娠病例中,B超下出血最大径小于3cm者占76.63%,出血最大径在3-6cm之间的占23.37%,出血最大径大于6cm者占0%。
综合评价详见本节(四)2.。

6.初始血β-HCG定量
从表18,图7可以看出,符合药物保守治疗的184例输卵管妊娠病例中,初始血β-HCG值小于1000IU/L者占71.2%,初始血β-HCG值在1000-3000IU/L之间者占23.37%,初始血β-HCG值大于3000IU/L者占5.43%。
综合评价详见本节(四)1.。

7.病情影响因子评分模型
中医治疗输卵管妊娠,继承了中医辨证论治的精髓,积极采用各种先进的检测手段,以期早诊早治,同时将辨证分型和输卵管妊娠的病理发展阶段结合起来,从而探索出一套中西医结合的治疗方案。
我科在邓高丕教授的带领下,经过近十年的临床研究,针对输卵管妊娠的治疗过程中存在的过急手术或盲目药物治疗的问题,对输卵管妊娠患者进行中医辨病分期和辨证分型,确定了输卵管妊娠的病情影响因子,制定了输卵管妊娠的病情影响因子评分模型,经计算其病情影响因子总积分后,按照不同的分期、证型和总积分,进行分组治疗。从而有效地指导了临床实践工作,解决了何时可以使用纯中药保守治疗,何时应该选择中西医结合保守治疗,何时应该果断地决定手术等问题。并且在临床实践中,取得了较佳的治疗效果。
方案的合理性及优化方案目前仍在进行多中心临床研究。

(三)纳入研究者各治疗组疗效分析
1.有效率比较
(1)符合纯中药治疗两组的疗效结果
从表23可以看出,符合纯中药保守治疗的119例输卵管妊娠病例中,观察组82例,有效率为81.71%;观察组37例,有效率为64.86%;两组有效率比较差异具有统计学意义(P<0.05)。
在相同的积分条件下,纯中药保守治疗输卵管妊娠的有效率比单纯米非司酮保守治疗的有效率高。这正是凸显了在输卵管妊娠的早期阶段,胚胎活性较低的情况下,纯中药综合治疗输卵管妊娠的优势。中药汤剂辨证论治,化瘀消癥杀胚并可针对兼证进行治疗;结合外治法——中药外敷通过局部而发挥活血化瘀,透达经络的直接作用,又能改善局部血液循环;中成药及中药针剂的使用,除了用药时间恒定,更重要的是可使血药浓度保持在一个较平稳的水平,从而提高了输卵管妊娠的治愈率。

(2)符合中西医结合治疗两组的疗效结果
从表24可以看出,符合中西医结合保守治疗的65例输卵管妊娠病例中,观察组45例,有效率为68.89%;观察组20例,有效率为60%;两组有效率比较差异无统计学意义(P>0.05)。从总体的有效率情况,可见符合中西医结合治疗两组的有效率均较文献报道稍低[39,145]。
分析其原因,考虑胚胎种植的部位及胚胎活性强弱是决定破裂与否及破裂早晚的主要影响因素。中西医结合保守治疗输卵管妊娠方案中,将血β-HCG>3000 IU/L设为一个病情影响因子下限数值——3分,但没有规定β-HCG的上限数值。目前国内正规书籍或方案所推荐的,允许保守治疗的血β-HCG最高上限数值,当属《中华妇产科学》中提及的5000-6000 IU/L[146]。而我们制定的“输卵管妊娠中西医结合治疗方案”不能排除将某些血β-HCG值大于6000 IU/L的病例纳入观察。
有学者定义保守治疗的异位妊娠情况下,需直接转手术治疗的指征为48 h内血β- HCG升高60%以上或给与MTX治疗后血β-HCG继续升高,从而避免异位妊娠破裂,至出血性休克的风险[147],此种提法,将血β-HCG值的波动水平考虑在内,毕竟血β-HCG水平上升幅度越大,则说明异位妊娠胚胎的活性就越大,而药物治疗的成功率就相应降低。
2009年-2010年间,中西医结合治疗输卵管妊娠的有效率稍低,除了一些客观的因素外,也为我们关于方案的修改和制定提出一些思考的方向。

2.有效病例的疗程时间比较
(1)符合纯中药保守治疗两组,有效病例实际用药时间比较
从表25中可以看出,符合纯中药保守治疗的119例输卵管妊娠病例中,观察组82例,有效67例,观察组37例,有效24例,两组有效病例实际用药时间比较差异无统计学意义(P>0.05)。
(2)符合中西医结合保守治疗两组,有效病例实际用药时间比较
从表26中可以看出,符合中西医结合保守治疗的65例输卵管妊娠病例中,观察组45例,有效31例,观察组20例,有效12例,两组有效病例实际用药时间比较差异无统计学意义(P>0.05)。
输卵管妊娠是一个特殊的疾病,没有固定的疗程,治疗的目标是妇科B超检查妊娠包块缩小,特别是血β-HCG测定连续两次阴性。“输卵管妊娠中西医结合治疗方案”所指定的疗程是4周,这是评价一个治疗方案成功与否所定出的时间限制。
疗程是一个患者十分关注的问题,因其涉及到住院时间的长短、医疗费用的多少、患者不同的心理承受能力以及由此导致的对药物保守治疗的信心和耐心。输卵管妊娠患者在药物保守治疗的过程中,会因为担心保守治疗不成功、再次宫外孕、继发不孕以及经济上的问题等而表现出紧张、焦虑、恐惧等负性心理[148,149]。而这些负性的心理情绪,会因为疗程的延长而愈加严重,从而会作出终止药物保守治疗或终止治疗要求出院的决定。这对于疾病的治疗和预后,均会产生十分不良的影响。
如何缩短疗程,提高疗效,是医护人员最为关注及追求的目标。观察组和对照组的有效病例中,用药时间比较差异无统计学意义,说明按中西医结合输卵管妊娠治疗方案保守治疗,不仅疗效可靠,而且疗程可控。

3. 血β-HCG值下降时间比较
(1)符合纯中药保守治疗两组,有效病例血β-HCG值下降时间比较
从表27中可以看出,符合纯中药治疗的观察组和对照组之间,血β-HCG值下降至50%的时间比较差异无统计学意义(P>0.05);血β-HCG值下降至10%的时间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。
(2)符合中西医结合保守治疗两组,有效病例血β-HCG值下降时间比较
从表28中可以看出,符合中西医结合治疗的观察组和对照组之间,血β-HCG值下降至50%的时间比较差异无统计学意义(P>0.05);血β-HCG值下降至10%的时间比较差异无统计学意义(P>0.05)。
HCG 是由合体滋养细胞合成并分泌的一种糖蛋白,由α、β两个亚基组成,为妊娠的特异标志,HCG 的产生直接与滋养细胞的数量和对数生长有关[150]。如果HCG 滴度下降,说明滋养细胞活性在减退。钟慧萍[151]建议以治疗后血清β-HCG 下降是否呈对数作为临床疗效评价及判断预后的客观指标。治疗后血清β-HCG 下降越快,治疗成功率也越高。说明血清β-HCG 检测,可作为异位妊娠药物保守治疗效果监测的有效指标。
米非司酮是一种19-去甲睾酮的衍生物,具有抗糖皮质激素,抗孕激素和流产作用,在受体水平起效。早期异位妊娠的杀胚治疗正是利用了米非司酮能作用于受体水平的抗孕酮药物,它本身无雌激素、孕激素、雄激素的活性,与孕酮受体的亲和力比孕酮强5倍,能与内源性孕酮竞争结合受体,产生较强的抗孕酮作用,使妊娠黄体萎缩,引起蜕膜和绒毛变性,导致出血和HCG下降,阻止胚胎发育这一特点。陈建明[152]研究发现,药物治疗效果与初始血清β-HCG与隔日血β-HCG浓度的比较有关,可根据隔日血β-HCG与初始β-HCG浓度比较来预测米非司酮治疗输卵管妊娠的疗效。
而活血化瘀、消癥杀胚中药中,含有天花粉,能使胎盘绒毛膜滋养细胞变性坏死而止血,最后坏死组织吸收而愈[153]。赤芍、丹参、桃仁能有效地松解变性的绒毛与输卵管组织的粘连[154]。且中医药综合治疗输卵管妊娠的另外一个优势是对其兼证的辨证治疗,这不仅可以保证治疗的顺利进行,对于缩短疗程及病人体质的恢复都有很大帮助。 
血清β-HCG主要反映滋养细胞活跃程度,其下降速度反映药物作用的效果[155]。本研究治疗表明,两组病例血β-HCG值从峰值下降至50%的治疗天数差异无显著性( P>0.05),表明通过运用两种不同的方法治疗,在前半期其抑制滋养细胞活性疗效相当。这可能与杀胚药物的作用时效有关,杀胚药物作用于病灶导致绒毛坏死,滋养细胞破裂,短时间内释放出β-HCG 以致其水平略有上升可能,而经过两个半衰期后检测结果才能真正反映出药物的疗效。而符合纯中药治疗组,其血β-HCG值从峰值的50%下降至10%的时间比较具有统计学意义(P<0.05),表明在HCG下降趋势稳定之后,中药综合保守治疗,较单纯米非司酮后的杀胚效果更佳。 

4.药物安全性评价
药物除了治疗效果之外,药物安全性也是我们十分关注的内容。米非司酮主要的不良反应表现包括轻度恶心、呕吐、眩晕、乏力及下腹痛;部分对象可能出现呕吐、腹泻;或表现为皮疹,皮肤潮红、发麻。在本次纳入对照的病例之中也有发生,但均表现为轻度的不适,停药及对症治疗后可愈。
中药治疗集中在外敷药引起的皮肤过敏及化瘀消癥杀胚复方对胃肠道的刺激方面,外敷药引起皮肤过敏的发病机制主要是外敷药后腠理闭塞,湿热内蕴,发于肌肤而成,与个人体质也有很大关系,若发现该类患者,停止敷药即是一个最有效的方法。化瘀消癥杀胚中药对胃肠道的刺激作用,可通过辨证论治及药物配伍得以解决。

(四)纯中药保守治疗的适用范围
输卵管妊娠中西医结合治疗方案中指出,未破损期-胎元阻络型,积分≤8分,当β-HCG<1000 IU/L且B超下包块<5cm时,选择纯中药治疗;或已破损期-正虚血瘀型,积分≤9分,当β-HCG<1000 IU/L时,选择纯中药治疗。
从方案制定可以看出纯中药保守治疗输卵管妊娠的关键点:一是积分相对较低;二是血β-HCG值水平<1000 IU/L;三是B超下包块<5cm。治疗前血清β-HCG水平(绝对值水平)和附件包块大小(绝对值水平)是传统沿用于选择药物保守治疗适应证的指标。
1. 血β-HCG绝对值水平
一般情况下,在受精后第6天,受精卵滋养细胞形成并开始分泌少量HCG,此后每2天左右即增长一倍,倍增时间为1.7-2.4天,当受精第7-8天受精卵着床之后,即能在孕妇尿和血中用β- HCG 抗血清测出HCG 的存在[156]。但影响血β-HCG 量的因素较多,如停经时间、胚胎着床的部位、滋养细胞的数量、滋养细胞的质量等[157]。输卵管妊娠时因胚胎植入的部位是在输卵管,植入部位血管网络不及宫内着床部位丰富,加上胎盘组织外有包膜形成,使得β-HCG分泌量减少,进入血循环时间延迟,血β-HCG显著低于正常妊娠,且其倍增时间也远较正常妊娠延长,可长达3-8天[158-159]。
输卵管妊娠患者药物保守治疗能否成功一个很重要的因素是患侧输卵管肌层的完整性,而输卵管肌层的完整性又取决于滋养细胞侵入输卵管壁的深度。血β-HCG 水平较高的患者,滋养细胞有较高的增殖活力,很容易侵入输卵管壁肌层。而输卵管壁肌层为滋养细胞提供丰富的血液供应和营养物质,滋养细胞增殖更加活跃,使血β-HCG 水平进一步升高。近年来,有国外学者发现血β-HCG水平与滋养细胞侵入输卵管壁的深度相关。Natale等[160]对37 例壶腹部妊娠进行研究发现:40.5%的患者侵入粘膜层,37.8% 的患者侵入肌层,21.6%患者侵入浆膜层,而当血清B-HCG>6000 IU/L 时,所有患者滋养细胞侵入输卵管壁达肌层或浆膜层。
血β-HCG绝对值水平是预测药物保守治疗重要因素之一,但目前数值尚不统一。我们从《妇产科学》[142]及《中华妇产科学》[146]中对异位妊娠的保守治疗所提及的条件可以看出:均在强调生命体征平稳,无明显内出血征象,血常规、肝肾功能正常的条件下,第七版《妇产科学》认为血β-HCG<2000 IU/L,盆腔包块直径<4㎝为绝对指征,而《中华妇产科学》则推荐血β-HCG 5000-6000 IU/L以下即可保守治疗。国外保守治疗异位妊娠的文献提到的血β-HCG的可被保守治疗范围,绝对值范围也有不同,美国生殖医学会临床实践指南认为血β-HCG<3000 IU/L,无明显临床症状为药物保守治疗适应证[161],最近的一项系统评价则认为血清β-HCG水平>5000 IU/L者,药物保守治疗成功率下降,故将血清β-HCG水平>5000 IU/L作为药物保守治疗相对禁忌证[162]。
血β-HCG值是胚胎活性的一个重要指标,纯中药保守治疗提及的血β-HCG定量<1000 IU/L,是因为中药毒副作用少,在异位胚胎活性较低的情况下,可完全代替西药,单纯中药综合治疗,而起到改善盆腔内环境,缩小包块,防止破裂发生及缩短治疗疗程的作用。若血β-HCG定量>1000 IU/L,提示胚胎活性较强,则此时应结合西药杀胚优势,两者优势互补,结合应用。

2. B超下包块的大小
B超下包块的大小,是传统沿用的一个保守治疗指标,但在近些年其重要性也受到了挑战。Natale等[160]进行了一项RCT研究,目的是探讨停经天数、附件包块和血清β-HCG水平与输卵管妊娠时滋养层细胞浸润管壁深度之间的关系,结果发现滋养层细胞浸润深度与附件包件大小并无相关性(P>0.05),由此认为附件包块大小不能反映滋养层细胞浸润输卵管壁的深度,对异位妊娠保守治疗的监测作用有限。输卵管病理研究表明:异位妊娠的附件包块,主要是由于滋养细胞侵入输卵管壁的血管、血凝块与妊娠物混合导致输卵管扩张形成。输卵管妊娠时超声可见不同的声像图,附件包块多为绒毛、胚胎、凝血块及输卵管或肿大的卵巢混合声像,即使在阴道超声下也难以将妊娠的输卵管与其周围机化的血块及包裹的组织区分开来[163]。因此B 超测量附件包块的大小,不能反映滋养细胞侵入输卵管壁的深度。虽然,超声学发现附件包块大小的绝对值并不能预测成功,但包块的消长情况却与成功密切相关,因此提倡使用动态变化指标[164]。
B超下包块>5cm,则应选择中西医结合治疗,而非纯中药治疗,乃因包块越大,提示滋养细胞侵袭或血肿对输卵管造成的张力越大,为防止包块破裂,病情剧变导致气血亏脱,则需增加西药杀胚,抑制滋养叶细胞活性和侵袭力,同时发挥中医药综合治疗的作用,预防病情突变。

3.小结
综上,治疗前血HCG水平是影响成败的最关键因素,而停经时间、腹痛程度、B超下包块最大径和B超下出血最大径等病情影响因子对治疗成败有影响,而且这些病情影响因子的高低及关键因素的动态变化,应当成为我们选择合适的治疗措施的参考条件。

(五)中医药在输卵管妊娠各期的治疗中应用广泛,具有优势
1.杀胚,使绒毛失去活性,加速血HCG下降的速度,增加了输卵管妊娠药物保守治疗的成功率。
2.部份早期输卵管妊娠,可单独应用纯中药治疗而取效,从而减少西药的毒副作用和手术的风险。
3.其他期、型的输卵管妊娠,配合中医治疗能帮助提高疗效,缩短疗程。
4.中医药治疗输卵管妊娠的另外一个优势是对其兼证的辨证治疗,有利于患者体质的恢复。 
5.中医药保守治疗费用较手术治疗费用低,适应症患者住院时间平均在2-3周左右,病人容易接受,临床依从性较好。

第三章  实验研究
——化瘀消癥杀胚复方含药血清对输卵管妊娠滋养细胞的影响

第一节  输卵管妊娠滋养细胞的培养
一、研究目的与内容
人类绒毛组织滋养层细胞是一种妊娠相关细胞,在胚胎植入、母胎免疫耐受过程中发挥重要作用。人类绒毛滋养层细胞体外培养用于妇产科、生殖医学、分于生物学等多种研究领域,可避开用人体实验进行研究所带来的伦理学问题。查阅国内外资料,目前以培养妊娠早期胎盘绒毛滋养细胞最为多见,绒毛滋养细胞培养的培养技术、分离纯化及鉴定方法也已较为成熟。
但输卵管妊娠部位的绒毛滋养层细胞体外培养的报道鲜见。本研究拟选取临床未服用药物,直接行手术治疗的输卵管妊娠患者的输卵管妊娠部位绒毛组织,进行滋养细胞体外培养,建立能反映人输卵管妊娠的细胞培养模式,希冀为输卵管妊娠的应用基础研究探寻一种可靠稳定的模型研究载体。

二、标本采集
(一)研究对象
1.病例来源
所有研究对象均来源于2010.3-2010.9在广州中医药大学第一附属医院妇科住院的输卵管妊娠患者,所有研究对象必须严格按照下列的诊断标准、纳入标准和排除标准进行筛选。

2.诊断标准
(1)有停经史(个别无明显停经史),下腹疼痛(小部分可无下腹疼痛),或有不规则阴道流血。
(2)妇科检查:子宫常大或略大,一侧附件或可触及包块,有压痛。
(3)β-HCG阳性。
(4)盆腔B超:宫内未见孕囊,宫旁出现液性或混合性回声区,或该区有胚芽或原始心管搏动;或宫旁回声区无输卵管妊娠声像特征,但腹腔内存在无回声暗区或直肠子宫陷凹处有积液。
(5)诊断性刮宫及病检未见绒毛。

3.纳入标准
(1)符合诊断标准(1)-(4), 参考诊断标准(5)。
(2)患者入院后未服用药物,直接要求手术;或因输卵管妊娠破裂、流产而行急诊手术治疗者。
(3)已签署手术知情同意书。

4.排除标准
(1)不符合诊断标准及纳入标准者。
(2)非输卵管妊娠的异位妊娠患者。
(3)术前曾经药物治疗干预过的患者。

(二)取材方法
    取术中证实为输卵管妊娠患者的绒毛组织,快速送往实验室无菌操作台,在无菌条件下置于水浴PBS液中充分洗涤3次,仔细去除蜕膜及血污后进行绒毛滋养层细胞培养。

(三)技术路线图

三、材料与方法
(一)材料
1.实验材料
0.25%胰酶,吉诺生物(USA);
胎牛血清,GIBCO(USA);
牛血清白蛋白,GIBCO(USA);
DNA酶,吉诺生物(USA);
BIO-AMF-2滋养层专用培养基,Bioind (以色列);
超净水,电导平18-2(自制);
异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗人细胞角蛋白18(anti CK-18-FITC)(北京博奥森);
荧光素(CY3)标记抗人波形蛋白(anti Vim-18-CY3)(北京博奥森);
总β亚单位人绒毛膜促性腺激素测定试剂盒(化学发光法)(美国贝克曼);
秋水仙素(sigma);
Giemsa染料(sigma);
激光共聚焦专用皿;
无水乙醇等分析纯;
眼科剪,眼科镊;移液器,无菌枪头;
培养瓶,培养皿,75%酒精等一批。

2.主要仪器设备
317型 CO2培养箱,Thermo(USA);
SW-CJ-IF型 净化工作台(苏州净化);
21-R型 冷冻离心机,Thermo(USA);
1.6-R型 冷冻离心机,Thermo(USA);
TD25-WS型 自动平衡离心机(长沙湘仪);
CX5PRO型 电热恒温箱(苏州江东);
LSM-710型 激光共聚焦显微镜,ZEISS(GER);
TS100型 倒置显微镜,Nikon(JP);
E200型 三目显微镜(Nikon,JP);
    DXI 800型 全自动化学发光免疫分析仪(Beckman USA)。

3.培养条件
培养液为BIO-AMF-2滋养层专用培养基,pH值7.0-7.2,于37℃,5%CO2条件下培养,每日观察细胞生长情况,当细胞长满瓶底90%左右时,用0.25%胰蛋白酶消化传代。

(二)方法
1.滋养细胞的原代培养
(1)取材,将输卵管妊娠的绒毛组织置于PBS液中充分洗涤3次,仔细去除蜕膜及血污。
(2)在无菌操作台,将剩余组织剪碎至1mm3左右,约1ml,收集至离心管中,加入等体积0.25%胰蛋白酶液。
(3)于37℃水浴中振荡消化约10min。
(4)900转离心10分钟,弃上清。
(5)将剩余组织轻吹打混匀后均匀铺入培养瓶中,加入1ml BIO-AMF-2滋养层专用培养基。
(6)37℃二氧化碳培养箱中培养1小时后取出,吸出上清及漂浮组织转入离心管中。
(7)离心后弃上清,将剩余组织轻吹打混匀后均匀铺入培养瓶中,加入1ml BIO-AMF-2滋养层专用培养基。
(8)1小时后吸去上清及漂浮组织,离心管收集,离心后弃上清,将剩余组织轻吹打混匀后铺入新培养皿中。
(9)加入1ml BIO-AMF-2滋养层专用培养基,培养1小时后再补入3ml 2ul双抗。置二氧化碳培养箱中继续培养。

2.差异贴壁法分离滋养细胞
(1)在细胞贴壁生长良好的培养瓶中,加入0.25%胰酶消化5min,加培养基终止消化,离心弃上清。
(2)铺入新培养瓶中,加培养基3ml,轻轻吹打后,静置20min。置倒显微镜下观察,成纤维细胞贴壁(稍加摇荡也不浮起),由于成纤维细胞比上皮细胞贴壁快(成纤维细胞的贴壁时间为数十分钟,而滋养细胞贴壁时间为l-2h),此时贴壁细胞主要为成纤维细胞,上皮细胞大多悬浮在培养液内,将培养液收集于另一培养瓶中。重复3次,后铺瓶,置于CO2培养箱中,2日后观察。
(3)观察可见大部分细胞伸展呈圆形,5、6天后,细胞数量增多,呈三角形,连接成片,部分呈长梭形。
(4)待细胞长满瓶底90%左右时,用含0.02%的Na2EDTA和0.25%的胰酶消化液传代。
(5)传代,部分冻存。

3. 人输卵管妊娠绒毛滋养细胞的传代培养
当细胞长满瓶底90%左右时,用0.25%胰蛋白酶消化,计数板计数,达到1.0×107个/ml时分开以5.0×106个/ml接种于培养皿中继续传代培养。

4.细胞扩增
用0.25%胰蛋白酶消化,计数板计数,达到1.0×107个/ml时分开以5.0×106个/ml接种于培养皿中继续培养。细胞培养数由5皿扩增成10皿,继续后续实验。

5.免疫荧光激光共聚焦显微镜扫描法鉴定人输卵管妊娠绒毛滋养细胞
(1)制作细胞爬片:用0.25%胰蛋白酶消化,计数板计数,以2.0×106个/ml的细胞悬液浓度接种于激光共聚胶专用皿中继续培养。
(2)培养条件:37℃,5%CO2培养箱;24h后细胞贴壁,换液。
(3)三天后,观察细胞贴壁良好、长成单层。预冷,0.01×PBS洗两次5min,吸走洗液,加入95%乙醇5ml固定30min,-20℃保存。
(4)取出复温,预冷0.01×PBS洗三次5min,吸走洗液,加3ml5%BSA RT封闭1h,锡纸包封避光。
(5)滴加1:1混合的FITC标记抗人细胞角蛋白18,CY3标记抗人波形蛋白20ul,4℃过夜。
(6)取出后复温;预冷0.01×PBS洗五次5min。
(7)激光共聚焦显微镜观察:样品在激光共聚焦显微镜(ZEISS LSM-710)下扫描,光源分别用488 nm 和543 nm波长的激光器激发绿色和红色荧光,控制软件为ZEN2008,模式为best signal双通道扫描,扫描分辨率为1024 ×1024 pixel,用于图像采集的显微镜物镜为ZEISS 20×物镜,激光强度为192,Pinhole为1AU,Master Gain为238,计算机数据采集,数字成像。

6. 化学发光法测定培养液中的β-HCG亚单位
(1)将培养液添加到含兔抗β-HCG-碱性磷酸酶结合物和包被着山羊抗鼠Ig-G-小鼠单克隆抗β-HCG复合物的顺磁性微粒的反应管中。
(2)在反应管中温浴完成。
(3)将化学发光底物Lumi-Phos*530添加到反应管中,由照度计对反应中所产生的光进行测量。
(4)所产生的光的量,由Access免疫测定系统所储存的多点校准曲线测定。

7.滋养细胞生长曲线检测
(1)采用常规消化传代法。将细胞以5×103密度接种于25ml培养瓶中,共接14组,每组3瓶。
(2)每天检查1组,每瓶计数4次,取均值,再累计3瓶均值。连续计数2周,绘制逐日细胞数。
(3)以培养时间为横轴,细胞数为纵轴,连接成线即成滋养细胞生长曲线。
8.滋养细胞细胞分裂指数检测
(1)将细胞悬液接种在有盖玻片的培养皿中,逐日取盖玻片,取前3小时加入终浓度为0.02ug/ml的秋水仙素,固定、Giemsa染色、封片,镜下观察分裂相并计数。
(2)取得逐日分裂指数后,绘制细胞分裂指数曲线。

四、结果
(一)细胞形态学
倒置显微镜下观察:观察可见大部分细胞伸展呈圆形,1h后可见部分细胞贴壁,24h后大部分细胞贴壁,5、6天细胞数量明显增多,呈三角形,连接成片,部分呈长梭形。可见细胞为上皮样细胞形态,呈片状铺展生长。显微镜下细胞形态见附录:附图1。

(二)免疫荧光染色
    采用直接免疫荧光双标显微技术检测FITC标记的CKl8和Cy3标记的波形蛋白,在激光共聚焦显微镜下可见细胞胞浆中有丝状绿色荧光的为CKl8阳性信号,胞浆包膜染色;未见红色荧光的波形蛋白信号,说明分离的细胞中无间质细胞生长,见表29;激光共聚焦显微镜下图见附录:附图2。

(三)滋养细胞的分泌功能
    6例体外培养的滋养细胞,1.0×106/cells,传代培养24h,在换液时留取培养液,检测绒毛膜促性腺激素(HCG)含量。结果最高值为19.43 IU/L/1.0×106cells,最低为1.92 IU/L/1.0×106cells,见表30。

(四)滋养细胞生长曲线
实验结果显示细胞传代后的6天为滋养细胞的对数生长期,12天后即进入平台期。细胞生长曲线见表31,图10。

(四)滋养细胞分裂指数
体外培养细胞生长、分裂繁殖的能力,可用分裂指数来表示。细胞分裂指数,是计算分裂细胞占全部细胞中比例的方法,用以表示细胞的增殖旺盛程度。一般要计算和观察1000个细胞中的分裂细胞数。它与生长曲线的趋势类似,随着分裂指数的不断提高,细胞进入了对数生长期;细胞总数达到平台期时,细胞数量很大,但细胞的分裂增值接近停止,分裂指数曲线值最低。
实验结果显示细胞传代后的6天开始,分裂指数上升明显,第10天为滋养细胞的分裂指数最高峰,第12天后明显下降。细胞分裂指数见表32,图11。

五、讨论
(一)滋养细胞体外培养
人类胚胎植入的过程也是母胎半相合移植免疫耐受形成的过程,人绒毛膜滋养层细胞在胚胎植入过程中起着重要的调节作用。尤其早孕期绒毛膜滋养层细胞,在胚胎植入的侵袭和免疫调节中发挥关键作用[165]。正常胚胎的发育需要顺利植入子宫不被母体免疫系统排斥,及时打开子宫的血液循环以供应胚胎发育所需要的营养,分泌多种激素以维持妊娠。
体外培养研究人绒毛膜滋养层细胞,由于不受复杂内外界环境的影响,可对细胞进行各种条件下的干预研究,因而对研究其作用和机制提供了一种很好的实验手段。
输卵管妊娠部位的绒毛滋养层细胞,同样具备具有内分泌功能的合体滋养细胞和具有侵袭活性的绒毛外滋养细胞,故参照培养早期宫内妊娠的绒毛滋养层细胞培养方法,体外分离培养输卵管妊娠部位绒毛滋养层细胞。

(二)输卵管妊娠滋养细胞的分离及纯化
现有的滋养层细胞原代培养方法主要有组织块培养法和消化分离法[166],组织块培养法因污染细胞多而杂,不易纯化,且原代细胞生长周期长,约需要20天左右,故一般不被采用。本实验原代培养采用的是胰酶消化法消化分离细胞。人妊娠早期绒毛主要含有滋养层细胞和间质细胞,滋养层细胞又分为合体滋养层细胞和细胞滋养层细胞。由于合体滋养层细胞较大,分散过程中易受损伤,附壁能力差,合体滋养层细胞分化成熟,不能进行再分裂,传代培养中的,合体滋养层细胞主要由细胞滋养层细胞分化出来的[167]。
如何排除间质细胞等其他细胞成分而保留所需细胞成分是绒毛滋养层培养成功的关键。本实验中取材来源于输卵管妊娠的滋养细胞,同样存在着滋养层细胞和间质细胞两种主要成分。本实验利用成纤维细胞和上皮细胞贴壁过程快慢的差异[168],采用差异贴壁法分离纯化滋养细胞,多次重复操作,从而去除了成纤维细胞。

(三)输卵管妊娠滋养细胞的鉴定
1.形态学
细胞培养需进行细胞鉴定,滋养细胞主要与间质细胞鉴别。通过光镜观察细胞的大体形态生长特性可粗略鉴别,通常情况下,离体培养的上皮细胞为扁平三角形,呈片状生长,细胞生长形态与成纤维细胞不符合,基本排除成纤维细胞。

2.免疫荧光染色
细胞光镜的形态表述不能用于定性,细胞鉴定还需要检测细胞骨架,目前国际上比较认同的分子标志包括有细胞角蛋白(cytokeratin),细胞波形蛋白(vimentin)等。角蛋白是构成上皮细胞骨架蛋白,波形蛋白是内皮细胞及间质细胞的标志蛋白[168,169]。一般研究认为,上皮来源的绒毛膜滋养层细胞只表达细胞角蛋白,而不表达波形蛋白[170]。
本实验采用直接免疫荧光双标显微技术检测FITC标记的CKl8和Cy3标记的波形蛋白,在激光共聚焦显微镜下可见细胞胞浆中有丝状绿色荧光的为CKl8阳性信号,胞浆包膜染色;未见红色荧光的波形蛋白信号,说明分离的细胞中无间质细胞生长。进一步证实了体外所培养的细胞为滋养细胞。

3.分泌功能
滋养细胞约在受精后的4d出现,为一层扁平细胞构成细胞壁,可分为两种类型:合体滋养细胞和细胞滋养细胞。滋养细胞在整个妊娠期间都有旺盛的内分泌功能,除分泌GnRH、促甲状腺刺激释放激素(TRH)、生长抑素、催乳素、绒毛膜促甲状腺素等含氮激素外,还分泌孕酮(P)、雌三醇(E3)等类固醇激素以及分泌多种妊娠特异蛋白质、儿茶酚胺类物质和抑制素等。人绒毛膜促性腺激素(HCG)是在妊娠早期胎盘绒毛组织所分泌的糖蛋白激素,具有延长妊娠黄体寿命和调节胎盘甾体激素合成的功能[171]。
目前已明确,滋养层细胞分为细胞滋养层细胞和合体滋养层细胞。细胞滋养细胞是分裂生长的细胞,可进一步分化为中间型滋养层细胞核合体滋养层细胞[172];中间型滋养层细胞,是细胞滋养层与合体滋养层之间的过渡型细胞,已经能够合成和分泌HCG,但其分泌功能尚低;合体滋养细胞是由细胞滋养细胞分化而来,是行使功能的细胞[173]。Lysiak[174]报道体外培养人绒毛滋养层细胞合体细胞约38%。
早期输卵管妊娠,β-HCG值是十分被关注的一项指标,因其能反映滋养细胞分泌功能和活跃程度,进而表现为对着床部位的侵袭和破坏。早期输卵管妊娠的绒毛滋养细胞,也应具有分泌β-HCG的功能。故本实验取传代培养的培养液,进行β-HCG检测,从表30中可见,培养液中具有β-HCG的存在,其均值为10.03±7.82 IU/L,说明体外培养条件下的滋养细胞,具有合成激素能力,进而说明了滋养细胞形态与功能分化的统一性。
杨柳[31]等取新鲜绒毛组织进行体外培养,并加入一定剂量的紫草乙醇提取物,抽取培养液,用放射免疫法测定培养液中HCG含量,空白组的HCG基础值为784.2±8.06mIU/ml。周楚华[175]等取人早孕胎盘滋养细胞进行体外培养,检测HCG分泌与培养时间及细胞数量的关系,发现随着培养时间延长,HCG分泌量增加,16h达到最高值,而后维持在较高水平;且细胞数量不同,分泌量也不同,随细胞数量增加,HCG分泌增加。
本实验所取之细胞培养液HCG值较低,考虑其原因,乃因培养细胞的来源为输卵管妊娠部位的滋养细胞,滋养细胞的分泌功能较宫内妊娠者差,HCG分泌水平较宫内妊娠者低。推测不同部位的滋养细胞,在体外培养后表现出来的不同的分泌特点,可能与来源细胞不同的种植部位和微环境不同所引起的。

(四)输卵管妊娠滋养细胞的细胞特性
陈晓[88]等报道,绒毛膜细胞主要是滋养层细胞,有丝分裂活跃,生长迅速,培养24小时后可见组织块边缘有细胞迁出,于10-15天左右生长最迅速。王云[61]等报道,原代早孕人滋养细胞接种后第3天细胞生长开始加快,3-6天细胞增殖明显加快,至第7天后复又减慢,进入平台期。施琼[82]等实验显示细胞消化传代后的12-48h为胚胎细胞的对数生长期,48h后即进入平台期。
本实验所培养的滋养细胞,原代细胞24h后大部分细胞贴壁,5、6天细胞数量明显增多,6天为滋养细胞的对数生长期,12天后即进入平台期。一般原代培养的生长周期较缓慢,另考虑本实验所取之细胞为输卵管妊娠滋养细胞,绒毛组织的密度明显较宫内妊娠者稀疏,故在原代培养的早期,细胞的活力较差。

(五)宫内外滋养细胞培养的异同
李幼飞[79]等研究指出,取材的绒毛若支体粗大稀疏,消化后细胞量明显不足,且细胞活力差,培养不易成功;绒毛分支稠密呈密集的绒状,则培养时细胞数量多,活力好,接种后细胞易贴壁,且生长迅速。
由于输卵管妊娠部位的绒毛组织,较宫内妊娠者体积细小,绒毛密度较稀疏。而且常因手术等原因,夹杂有较多的血细胞,或断裂而分散。行剖管取胚术者,在术中取出时,多为细散,破碎,不完整的绒毛组织,一般粘附在蜕膜组织中,被血细胞包围;行输卵管切除术者,形态可较为完整,则需要取材者在无菌的条件下,尽快地较完整地取出绒毛。由于母体细胞污染在绒毛取样中是常见的现象,对绒毛的挑选和净化,充分洗涤,仔细去除杂志、蜕膜及血污,减少和避免母体细胞污染是检测绒毛细胞分析结果准确性的前提条件。

第二节  化瘀消癥杀胚复方含药血清的制备

一、研究目的与内容
用临床上行之有效的化瘀消癥杀胚复方饲养大鼠,制备化瘀消癥杀胚复方含药血清,是用体外模拟代谢后药物有效成分直接作用于靶点的方式,探讨复方中药起效的作用机理。
以宫外孕I号方加味,分为高、中、低剂量组饲养大鼠,并设立甲氨喋呤组及生理盐水组作为对照组,制备含药血清并保存。观察化瘀消癥杀胚复方对大鼠一般情况和子宫、卵巢湿重的影响,初步判定中药的毒副作用。为体外培养输卵管部位滋养细胞提供含药不同的培养基。

二、材料与方法
(一) 材料
1.实验用药物
(1)中药饮片均购自广州中医药大学第一附属医院药房,产地、批号见表33。

(2)注射用甲氨喋呤:广州中医药大学第一附属医院中心药房供药,江苏恒瑞医药有限公司,批号:10050211,规格:100mg/瓶。
(3)生理盐水、水合氯醛等均为广州中医药大学第一附属医院门诊药房提供正品药物。

2.实验动物
健康雌性未孕SD大鼠30只,体重220g-240g,周龄12-15周。广东省医学动物实验中心提供,合格证号:0064134。
饲养条件:SPF级SD大鼠饲养在广东省医学实验动物中心SPF级实验室I,动物实验环境设施合格证号:SYXK(粤)2008-0002,室内保持20-25℃,湿度40-70%。自由饮水、进食,采用12h:12h昼夜间断照明,每周换水3次,换垫料2次,水料充足,SPF级饲料产自广东省医学实验动物中心。

3. 主要仪器
AEG-220电子天平,岛津(日本);
LXJ-2离心沉淀机(上海医用分析仪器厂);
中药罐、大鼠盒、注射器、灌胃器、试管、毛细玻管、甲醛标本小瓶、手术器械(刀及刀柄、弯钳、无齿镊若干)。

(二)方法
1.中药复方制备
化瘀消癥杀胚复方水煎剂:按《人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值表》换算,化瘀消癥杀胚复方水煎剂大鼠灌胃剂量是1.5g生药/100g体重。中药为广州中医药大学第一附属医院中药房一次性提供的正品中药,三层纱布包裹后,蒸馏水500ml浸泡30min,文火煎取150ml,煎煮三次,混合煎取液,水浴浓缩成剂量为1.5g/ml的药液,-20℃保存备用。

2.含药血清的制备
(1)动物与分组
取健康雌性未孕SD大鼠30只,随机分成中药7天组-高剂量,6只;中药7天组-中剂量,6只;中药7天组-低剂量,6只;生理盐水组,6只;甲氨喋呤组,6只。(注:中药7天高、中、低剂量的大鼠含药血清,用于后期实验——指纹图谱-质谱的检测,本研究中用于培养输卵管妊娠滋养细胞之血清,仅取中药7天中剂量组含药血清。)

(2)给药方法
①中药中剂量组所用药物血清的供体大鼠灌胃量按以下方法计算:根据王力倩[83]等提出的参考公式:给药剂量=临床常用量×动物等效面积系数×培养基内血清稀释度,计算给药剂量。
大鼠理论等效剂量是人的单位体质量剂量的6.25倍[176](样品的总生药量为人的一日服用量,按公斤体重公式: ,

拆算大鼠的等效剂量,作为给药剂量)。药物血清稀释度为5,所以单位体质量大鼠每次灌胃估计量为人的单位体质量剂量的31.25倍,计算后每只大鼠每次灌胃量约为1.5ml(5.4g/ml)。
②甲氨喋呤组大鼠予正常喂食7天,至第7天空腹12小时后肌注甲氨喋呤1mg/只(参照“动物与人体的每公斤体重剂量折算系数表” [176]计算所得)。
③生理盐水组大鼠予正常喂食及喂服0.9%氯化钠液7天。
(3)血清采集
末次给药1小时后在麻醉下行腹主动脉采血,将同组大鼠血清混合,56℃,30分钟灭活处理。22μm微孔滤膜过滤、除菌,-20℃保存,以备体外培养绒毛滋养层用。
(4) 指标检测
一般情况观察:每周测量3次体重、饮食量、饮水量,每日观察小鼠精神状态、活动力、反应,大便形态,腹泻等。
生殖器官湿重:解剖当日,取大鼠的子宫、卵巢进行称重。

3.统计方法
所有数据用SPSS15.0作统计学处理,计量资料先进行正态性检验和方差齐性检验,满足要求这两样本均数比较用t检验,未满足要求者两样本均数比较用秩和检验,数值用 _ x±s表示。

三、结果
(一)各实验组日常情况观察结果
化瘀消癥杀胚复方高、中、低剂量组,生理盐水组和甲氨喋呤组各组大鼠的精神状态、活动力、反应良好,无恶心、呕吐、腹泻等症状,大鼠在饲养过程中无一例死亡。

(二)化瘀消癥杀胚复方高、中、低剂量组对SD大鼠的体重、进食量、饮水量的影响(见表34、表35、表36)

从表34、35、36可见:与同一时间生理盐水组比较,化瘀消癥杀胚复方高、中、低剂量组大鼠体重从开始饲养/用药第4天/用药第7天差异无统计学意义(P>0.05);与同一时间生理盐水组比较,化瘀消癥杀胚复方高、中、低剂量组大鼠饮水量的差异无统计学意义(P>0.05);在饲养的第7天,中药高剂量组的大鼠进食量下降,与同一时间的生理盐水组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。

(三)化瘀消癥杀胚复方高、中、低剂量组及甲氨喋呤对SD大鼠的子宫湿重、卵巢湿重的影响(见表37)

四、讨论
(一)中药复方含药血清
1.概述
1987年,日本学者首次提出了“血清药理学”概念,指在动物经口服给药一段时间后采血分离血清,用此含药血清进行体外药理实验的一种实验方法,其为科学阐明中药复方的作用及其机制提供了新的研究方法[177]。运用血清药理学方法研究中药复方已被越来越多的学者认同和采用,尤其是给予中药后的动物血清添加法,可以视为复方的真正有效成分的“粗的药物”,避免了复方中难溶于水的成分对细胞产生干扰和毒性作用,同时通过体内的代谢后得到的血清药物,模拟了体内的内环境,更加准确地反映了药物的作用[178]。
中药复方多靶点作用机理认为,中药复方天然组合化学库中的多种有效成分以低于其某一单体成分治疗剂量进入人体后,有选择地反复作用于与某种疾病有关的多个直接靶点或间接靶点,从而达到治疗疾病的目的。故选择含药血清,因其能较接近地反映药物在体内的状态,使体外试验能更好重复在体试验的结果。
许多学者研究含药血清的时效,得出不同结论。时效即包括不同喂药时间和采血时间所获得的含药血清的药效。孟李[179]指出,重复多次给药使血药浓度达到稳定后,在一定时间范围内采血进行血清药理学实验均可获得较高而且相似的药理强度。然而冯伟[180]则发现,长时间(8d后采血)与短时间(1d)无明显差异。关键在于两个方面:一是基于目前中药复方多为临床验方,制备含药血清时必须紧密结合临床实践以及考虑实验的可操作性;二是药物在血清中的蓄积浓度必须达到或接近药物均值。
2.含药血清量效、时效关系及毒副作用的权衡
有研究认为[181],如果把含药血清作为一种药物来看待,那么,药量的大小主要取决于两个方面:一是动物的给药量,在一定范围内,动物给药剂量越多,进入血循环的药物就越多,血药浓度就高,因而所取含药血清的体外药理效应就越强;二是培养体系或反应体系中的含药血清浓度(体积比),血清浓度愈高则药量愈大。含药血清的量效是由动物给药量和血清浓度共同决定的,由于培养体系中血清浓度的增减是十分有限的(血清浓度过高会对细胞产生毒性作用,在研究含药血清抑制细胞增殖或促细胞凋亡作用时,有可能得出假阳性结果),所以,相对固定含药血清浓度,通过改变动物给药量来调整药物血清的含药量,是一种较为现实的办法。
然而,除了效果正相关性研究外,因随着灌胃时间的延长,灌胃药量的增加,某些药物的毒副作用对实验动物及其含药血清的影响程度如何,这方面的研究鲜有报道。

(二)化瘀消癥杀胚复方含药血清
本实验采用的是一种较为通行的给药方法,即每日给药2次,连续7天,末次给药后1小时采血,并解剖生殖器官称量湿重。30只SD大鼠在整个实验过程中精神状态和进食情况较为良好,无死亡发生;大鼠体重、饮水量及解剖当日的子宫、卵巢湿重与生理盐水组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。中药高剂量组,在第7天饮食量下降,与生理盐水组比较有统计学意义(P<0.05)。
化瘀消癥杀胚复方含有天花粉、紫草、赤芍属于清热药;丹参、桃仁属于活血化瘀药。天花粉微苦、微寒,紫草性寒而滑,赤芍味苦性微寒;清热药药性寒凉,易伤脾胃,大量或久用容易使脾胃气机受损,运化失常,从而出现纳呆、便溏等症。活血化瘀药善于走散通行,从而易耗血动血。王清任在论膈下逐瘀汤中言明活血化瘀中药方的应用原则为“病轻者少服,病重者多服,总宜药去病止”。主要是由于活血化瘀中药多为散气劫阴之品,药性走窜,故宜中病即止,或观察到已耗伤机体正气,则应重新辨治,防止并发症的出现和对机体正气的耗伤。
中药含药血清除了药效值得探讨之外,毒副作用发生的可能性也应该值得重视。某些中药如峻下、滑利、祛瘀、破血、耗气、散气等中药,是否会引发实验动物内环境的改变,在制作含药血清的同时改变动物的体质。目前报道制备含药血清多采用正常实验动物口饲给药后采血,观察其对正常或病理状态下离体器官、组织、细胞或体外培养细胞的作用[182-184]。但机体在不同状态下肠道内菌群簇存在差别,而中药复方制剂临床服药对象主要是病理状态的患者;口服后药物经动物的生理脏器和病理脏器,如消化道吸收和代谢,尤其是病变肝脏代谢后,由于个体差异或状态不同,药物自身和机体产生的变化可能有所差别,由此导致作用部位有效成分血药浓度差异。因此,研究病理状态下含药血清效应,其结果可能更真实[182],病理状态动物制备的含药血清实验经过更为复杂,其对体外培养细胞的影响仍有待进一步探索[183]。
本实验对实验用SD大鼠做了一些初步的观察和检测,从大鼠的精神、体重、饮食及解剖生殖器官湿重等方面,说明灌胃化瘀消癥杀胚复方7天,暂未引起大鼠消化功能和妇科靶器官的重大改变,未发现药物有重大的毒副作用。

第三节  化瘀消癥杀胚复方含药血清对输卵管妊娠滋养细胞凋亡的影响

一、研究目的与内容
选择符合中医药治疗的早期输卵管妊娠患者的输卵管妊娠绒毛组织,采用以体外培养的人输卵管妊娠滋养细胞作为研究载体,以化瘀消癥杀胚复方对SD大鼠进行灌胃后,采血所得的含药血清对人输卵管妊娠绒毛细胞进行培养,并设立甲氨喋呤SD大鼠含药血清及空白SD大鼠血清体外培养的输卵管绒毛滋养细胞作为对照组。通过①采用流式细胞法(FCM)检测细胞凋亡率;②蛋白质印迹法(Western Blot)检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达。拟从细胞凋亡方面探讨化瘀消癥杀胚复方对输卵管妊娠滋养细胞靶部位的作用机制。(技术路线详见图13)

二、人输卵管妊娠绒毛滋养细胞模型的建立
(一)材料
1.实验材料
0.25%胰酶,吉诺生物(USA);
胎牛血清,GIBCO(USA);
BIO-AMF-2滋养叶培养基,BIOIND (ISREAL);
生理盐水含药血清;
西药甲氨喋呤含药血清;
化瘀消癥杀胚复方含药血清。

2.主要仪器设备
317型 二氧化碳培养箱,Thermo(USA);
SW-CJ-2F型 净化工作台(苏州净化);
TS100型 倒置显微镜 Nikon(JP);
E200型三目显微镜Nikon (JP);
TD25-WS型自动平衡离心机,长沙湘仪;
21-R型 冷冻离心机,Thermo (USA);
1.6-R型 冷冻离心机,Thermo (USA)。

(二)方法
1.中药组:培养液中加入灌服化瘀消癥杀胚复方7天的中剂量组大鼠血清,含药血清的浓度选取5%。
2.生理盐水对照组:培养液加入生理盐水灌胃后的大鼠血清,含药血清的浓度选取5%。
3.西药对照组:培养液中加入甲氨喋呤肌注后的大鼠血清,含药血清的浓度选取5%。
4. 6组细胞分别与含药血清作用72h,制备悬浮细胞做细胞凋亡检测,提取总蛋白做Western-Blot。

三、化瘀消癥杀胚复方含药血清对输卵管妊娠滋养细胞凋亡的影响
(一)材料
1.实验材料
0.25%胰酶,吉诺生物(USA);
BIO-AMF-2滋养叶培养基,BIOIND (ISREAL);
AnnexinV-FITC+PI凋亡检测试剂盒,Beckman Coulter(USA);
无水乙醇等均为分析纯;
其他离心管等耗材

2.主要仪器设备
EPICS XL 型流式细胞仪,Beckman Coulter(USA);
余仪器设备同本节二。

(二)Annexin V- FITC + PI染色法流式细胞仪检测人输卵管妊娠绒毛滋养细胞凋亡步骤
1.取对数生长期细胞,吸出培养液,PBS洗一次,加入0.25%胰酶和0.02%EDTA-Na2适度消化,加含血清培养基终止消化后转入离心管,800rpm离心 15 min,去上清。预冷PBS洗2次,800rpm离心 15 min。收集细胞沉淀。
2.用5ml注射器将打入70%(预冷)乙醇,4℃固定过夜(一周内检测)。
3.取出复温,800rpm离心 15 min,去乙醇,预冷PBS洗2次,800rpm离心 15 min,加0.5mL Binding Buffer悬浮细胞,务必均匀吹散,浓度大约为1.0×106个/ml。4.细胞凋亡率检测步骤:
4.没做处理细胞组制备双阴性、Annexin V-FITC单染、PI单染、AnnexinV-FITC+PI双染细胞来设门和做荧光补偿。
5.在悬浮细胞液中加入5ul Annexin V-FITC,轻轻混匀后于2-8℃避光孵育15min。加入10ul PI后轻轻混匀后于2-8℃避光孵育10min,300目(孔径40-50微米)尼龙网过滤,上机检测。
6.功率为15mW,可调检测器为高敏感的光电倍增管(PMT),FITC激发光波长为488nm,发射波波长为525nm;PI激发光波长为488nm,发射波波长为630nm,散射光FS、SS检测,荧光信号FL1 FITC、FL3 ECD通道实时检测,收集Log 和Lin信号,重复三次。
7.控制与分析软件:信号采集 EXPO32 ADC XL 4 Color ,信号分析 Summit。

(三)结果
    滋养细胞与5%含药血清共同作用72h后,可提高滋养细胞的凋亡率,且中药的影响作用更显著。见表38,甲氨喋呤组与生理盐水组比较,细胞凋亡率上升,差异具有统计学意义(P<0.05);化瘀消癥杀胚复方组与生理盐水组凋亡率比较,细胞凋亡率上升,差异具有显著统计学意义(P<0.01);与甲氨喋呤组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。细胞凋亡率图见附录:附图3-5。

四、化瘀消癥杀胚复方含药血清对输卵管妊娠滋养细胞凋亡相关蛋白的影响
(一)材料
1.实验材料
兔抗人Bcl-2抗体(Bcl-2 Rabbit Ab-Cell),Signaling Technology,Catalog No:2876(USA);
兔抗人Bax抗体(Bax  Rabbit Ab-Cell),Signaling Technology,Catalog No:2272(USA);
兔抗人微观蛋白抗体(Tubulin Rabbit Ab),BIO-RAD(USA);
BCATM蛋白浓度测定试剂盒(BCATM Protein Assay Kit),Thermo (USA);
辣根过氧化酶标记羊抗兔二抗(HRP-Goat Anti-Rabbit二抗),Proteintech Group(USA);
蛋白裂解液(碧云天);
ECL Western Blot检测试剂盒(南京凯基生物);
0.25um PVDF膜,MILLIPORE(USA);
牛血清白蛋白,GIBCO(USA);
X光胶片(富士);
其它试剂均为分析纯。

2.主要实验仪器
5417R型 高速冷冻离心机,eppendorf(Germany);
Elx型 通用酶标仪,BIO-TEK(USA);
Power Pac HV型电泳仪,Bio-Rad(USA);
VE-180型电泳槽(上海天能);
VE-186型电转槽(上海天能);
TS-8 型转移脱色摇床(江苏海门麒麟医用仪器厂);
Universal Hood II型 凝胶成像系统,BIO-RAD(USA)。

(二)Western-Blot法检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax步骤
提蛋白→蛋白定量→电泳→电转→封闭→孵一抗→孵二抗→ECL发光→凝胶成像→灰度值分析
1.提蛋白:往培养皿加入100μl裂解液,10min内用细胞刮反复刮刷,充分裂解贴壁细胞后转移至离心管,暂不使用时-80℃保存。
2.蛋白定量:收集完蛋白样品,为确保每个蛋白样品的上样量一致,BCATM Protein Assay Kit定量每个蛋白样品的总蛋白浓度。
3.电泳:配制10%SDS-PAGE凝胶。在收集的蛋白样品中加进适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。100℃沸水浴加热5分钟,蛋白充分变性。冷却到室温后,把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内。电泳电压100V,时间为90分钟。
4.电转:PVDF膜甲醇泡5min。小心取出胶,盖上PVDF膜,电转电压300V,时间为120min。
5.封闭:转膜完毕后,立即把膜放置到预先预备好的Western洗涤液中,漂洗1-2分钟,以洗清膜上的转膜液。吸尽洗涤液,加进5%BSA封闭液,在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。
6.孵一抗:按照1:1000比例稀释一抗。吸尽封闭液,立即加进稀释好的一抗,室温侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。4℃缓慢摇动孵育过夜。回收一抗。加进Western洗涤液,在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后,再加进洗涤液洗涤5-10分钟。共洗涤3次。
7.孵二抗:吸尽洗涤液,立即加进稀释好的二抗,室温在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。回收二抗。加进Western洗涤液,在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后,再加进洗涤液洗涤5-10分钟。共洗涤3次。
8.ECL发光:使用ECL检测试剂盒来检测发光。X光胶片曝光,压片暗盒压片,手工洗照片。
9.胶片成像
10.灰度值分析

(三)结果
1.含药血清对Bcl-2蛋白表达量的影响
滋养细胞与5%含药血清共同作用72h后,可降低Bcl-2蛋白表达量。见表39,甲氨喋呤组与生理盐水组比较,Bcl-2蛋白表达量降低,差异具有统计学意义(P<0.05);化瘀消癥杀胚复方组与生理盐水组比较,Bcl-2蛋白表达量降低,差异具有显著统计学意义(P<0.01);与甲氨喋呤组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。Bcl-2的Western-blot胶片图见附图6。

2.含药血清对Bax蛋白表达量的影响
含药血清与滋养细胞共同培养72h后,Bax蛋白表达量未见有明显变化,见表40。两组含药血清与生理盐水组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。Bax的Western-blot胶片图见附图6。

五、讨论
(一)细胞凋亡
细胞凋亡(Apoptosis)是指细胞在一定的生理及病理条件下,遵循自身的程序,自己结束其生命的过程,最后细胞裂解为若干凋亡小体,被其他细胞吞噬。现在很多情况下,亦称为程序性细胞死亡(Programmed Cell Death,PCD)。
1.Annexin V-FITC+PI染色法流式细胞仪检测细胞凋亡
Annexin V-FITC+PI染色的原理是通过凋亡形态学检测——细胞膜改变进行的。细胞凋亡比较早期时,细胞膜即出现了一些改变,细胞膜磷脂双分子层中的磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内翻转到细胞膜外,暴露于细胞膜;Annexin V是一种Ca2+依赖的磷脂结合蛋白,在Ca2+存在的情况下,与磷脂酰丝氨酸有很高的亲和力,因此Annexin V是检测细胞早期凋亡的灵敏指标。当Annexin V被荧光素标记时,可在流式细胞仪上或荧光显微镜下检测到早期凋亡的细胞。细胞凋亡与坏死的最大区别为前者的细胞膜保持完整,而后者的细胞膜破碎。PI(硫化丙啶)作为一种可嵌入DNA双链的红色荧光物质,不能通过完整的细胞膜,因此对活细胞和早期凋亡的细胞不能染色,但可进入坏死细胞(包括晚期凋亡细胞),使其发出红色。
依据细胞凋亡早期,质膜质双层中的磷脂酰丝氨酸(PS) 由内层向外层迁移,但其通透性保持完好,因此用FITC 标记的磷脂酰丝氨酸结合蛋白(Annexin V)和核酸染料碘化丙啶(PI) 进行染色,细胞呈FITC+/PI-。细胞坏死在其早期,细胞膜的完整性就已破坏,此时细胞呈FITC+/PI+。经流式细胞分析可鉴别活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。在双参数流式细胞仪的散点图上,左下象限代表活细胞,为(FITC-/P1-);右上象限代表非活细胞,即坏死细胞及晚期凋亡细胞,为(FITC+/PI+);右下象限代表早期凋亡细胞,显现(FITC+/PI-);左上象限代表收集过程中出现损伤的细胞(FITC-/PI+)。
2.细胞凋亡与输卵管妊娠
妊娠时,由凋亡引起的程序化的细胞死亡发生在母儿双方接触面,在种植、蜕膜化中起到重要作用。凋亡总是由胚胎接触部位开始,但总以胚胎接触部位最显著。
输卵管妊娠传统上认为种植在输卵管管壁上,然而,这个种植的受精卵很快侵袭上皮进入肌层,因为管壁缺少粘膜层,侵袭入粘膜下层直达母体血管[58]。输卵管组织蜕膜发育不全,蜕膜为发育胚胎提供营养和保护它反抗母方免疫排斥反应的作用,输卵管妊娠胚胎难以发育或者死亡,缺乏蜕膜容易引起合体滋养层的细胞凋亡,使合体滋养层也失去了发生提供营养的作用,因此不易于胚胎发育成长[185]。
从表38可以看出,甲氨喋呤组及化瘀消癥杀胚复方组含药血清与滋养细胞作用后,细胞凋亡率上升,与生理盐水组比较,差异具有统计学意义(P<0.05);化瘀消癥杀胚复方组与甲氨喋呤组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。与含药血清作用后,凋亡发生增加,凋亡率升高,从而使滋养细胞对输卵管管壁无限制的增殖和侵袭减少,进而最大程度地保全输卵管组织的完整性,防止病情恶化的发生。诱导滋养细胞凋亡,可能是中医药发挥杀胚效应的机制之一。

(二)凋亡相关蛋白
1.Bcl-2、Bax及两者比例
Bcl-2是参与凋亡调控的基因家族。Bcl-2主要的生物学功能是增加细胞对多种凋亡刺激因素的抵抗力,不影响细胞增殖,只是减少细胞凋亡,延长细胞寿命[188]。Bcl-2在线粒体中可直接调节膜上通透性转换孔来调节线粒体膜的通透性,以阻止细胞色素C释放入胞质而抑制细胞凋亡。Bax是一种胞液蛋白,当凋亡发生时,Bax 从胞质中转移到线粒体膜上,并且形成一个通道,改变膜的通透性,引起细胞色素C释放入胞浆,激活Caspases家族,最终引起凋亡[189]。Bcl-2 通过抑制Bax插入线粒体膜或通过直接、间接的抑制Bax通道的活性来阻止细胞色素C 的释放 [190],来调控细胞的生死。
有研究表明,Bcl-2和Bax各自可形成同源二聚体, Bcl-2和Bax蛋白水平的相对高低与凋亡调控直接相关,Bax增高促进细胞凋亡, Bcl-2蛋白在胎盘中主要表达于合体滋养层细胞,而细胞滋养层较少表达 [191]。通常Bcl-2和Bax的比值决定了细胞凋亡的发生与否,当该值增加时抑制细胞凋亡,该比值下降时则促进细胞凋亡。

2.Bcl-2/Bax与输卵管妊娠
Bcl-2主要合体滋养层中表达,其表达量高于细胞滋养层[57]。在输卵管部位的妊娠,Bcl-2表达量升高,反映了输卵管滋养层细胞的无限制增殖,凋亡引导失调。这可能与输卵管妊娠由于植入部位不同使得母体微环境改变,导致滋养细胞自分泌因素和母体旁分泌因素的失调,进而影响了滋养细胞现在的侵袭活性与自我凋亡的调节能力[57]。
化瘀消癥杀胚复方与滋养细胞作用后,能使其抑制凋亡蛋白Bcl-2表达水平降低, Bcl-2/Bax的比例降低,其促凋亡机制可能是:一方面Bax通过与Bcl-2相关蛋白形成异源二聚体,使其失去抑制细胞凋亡的活性。Bcl-2和Bax可形成异源二聚体,这些蛋白在整合入膜时可能产生异源二聚体通道,该通道受Bcl-2和Bax比例的影响[192]。
从中医药治疗输卵管妊娠的角度考虑,随着时间的推移,化瘀消癥杀胚治疗使输卵管部位滋养细胞Bcl-2表达水平减低,Bcl-2/Bax的比例降低,凋亡率升高,使滋养细胞增殖能力减弱,侵袭的严重程度下降,输卵管不会因为输卵管妊娠病灶增殖和向输卵管粘膜基层内浸润生长而承受更大的张力,减小了破裂的风险,从而使疾病往好的方向发展,与刘凛[193]所报道的当Bcl-2水平升高使抗凋亡因素占优势,进而增强细胞侵袭活性,导致输卵管妊娠破裂的推理相似。Kucera也有相似推论[57]。
本研究的细胞凋亡率及细胞凋亡相关蛋白的结果是推导同样一个结论,即中药含药血清与滋养细胞作用后,使其细胞凋亡率上升,下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,降低Bcl-2/Bax比值,从而推断,化瘀消癥杀胚复方可能通过促进凋亡的途径起到治疗输卵管妊娠的作用。
在输卵管妊娠中,受精卵种植在输卵管代表一个形态学上正常的胚胎种植在不正常的位置,一方面其滋养细胞引起正常的免疫和分泌活动,另一方面输卵管组织蜕膜化不能够正常的发生[194],局部细胞凋亡及侵袭活性发生改变。恰是这个病理学的矛盾状态,为我们进行输卵管妊娠的研究提供了继续探索的方向。

六、小结
本文从临床试验和实验研究两个方面,探讨了化瘀消癥杀胚复方对输卵管妊娠的影响。临床试验运用前瞻性随机对照研究,对“输卵管妊娠中西医结合治疗方案”从病情影响因子、确诊后的治疗措施到治疗结局进行了客观的评价,论证了以化瘀消癥杀胚为主要治法的治疗方案对输卵管妊娠,疗效肯定且副作用少。实验研究从含有化瘀消癥杀胚成分的含药血清促进体外培养的滋养细胞凋亡,下调抑制凋亡蛋白Bcl-2的角度,阐述了中医药治疗输卵管妊娠起效的可能机制。

结  语

一、结论
异位妊娠是妇科临床中的常见病和多发病之一。据资料统计,异位妊娠发病率占所有已知怀孕总数的1%[1]以上,其中大部分为输卵管妊娠(95%)。近年来由于检测手段的灵敏和普及,医务工作者及患者对妊娠相关疾病的重视程度增高,使早期确诊率、药物保守治疗率及治疗成功率不断增高。
中医药在治疗输卵管妊娠上有其优势和特色,但如何准确地制定治疗方案及中医药作用的机制何如,则需要通过大量的临床验证及实验研究支持。本文围绕输卵管妊娠的中医药治疗,从临床和实验两个方面进行了一些探讨:
1.通过与纯西药组相比较,证实在符合中西医保守治疗输卵管妊娠范围内患者,依照“输卵管妊娠中西医结合治疗方案”进行治疗,治疗效果切实,副作用少。
2.“输卵管妊娠中西医结合治疗方案”仍有需要优化和完善的部分,如设立保守治疗的血β-HCG值上限,或动态血β-HCG值波动上限。
3.本研究成功地建立了输卵管妊娠滋养细胞体外培养模型,证实其可为其他的实验研究提供足够量的研究载体。
4.本研究探讨了化瘀消癥杀胚复方对输卵管妊娠滋养细胞细胞凋亡的影响。结论:化瘀消癥杀胚复方提高输卵管妊娠滋养细胞细胞凋亡率,诱导滋养细胞凋亡可能是其发挥杀胚效应的机制之一。
5.本研究探讨了化瘀消癥杀胚复方对输卵管妊娠滋养细胞凋亡相关蛋白表达的影响。结论:下调Bcl-2的表达,使Bcl-2/Bax比例下降,诱导凋亡的发生可能是其发挥杀胚效应的机制之一。
二、不足与展望
1.不足之处
(1)本研究对于“输卵管妊娠中西医结合治疗方案”中药物治疗的疗效评价主要是针对近期疗效进行的,其中主要包括临床症状的消失,B超下包块不增大以及血β-HCG值转阴等情况。而对于B超下包块消失的时间,更远期疗效输卵管复通率,再次妊娠率及生产率,再次输卵管妊娠率等尚不能作出较系统的评价。
(2)在统计治疗后血β-HCG降至50%及10%的时间时,受观察时间的限制,和β-HCG抽血的时间限制,大部分患者是选择较接近下降至50%及10%的数据时间,统计学上存在不精确的可能。
(3)本研究纳入对象均为广州中医药大学第一附属医院妇科的输卵管妊娠患者,研究结果可能受到病例所处的地域环境和生活习惯影响,“输卵管妊娠中西医结合治疗方案”的临床多中心循证医学研究课题目前正在进行中。
(4)本研究纳入对象为2009.1-2010.12的输卵管妊娠患者,因收集病例时间较短,各期、各证型患者分布比例相差较大,致使某些组别的样本量未能达到预期估算的数值,从而对统计结果造成一定影响。
(5)因为实际临床工作的可行性及输卵管妊娠疾病的特殊性,研究所采用的盲法是单盲法,采用的随机方法是不等的随机化对照,故仍然难以克服偏倚和随机误差发生的可能性。
(6)输卵管妊娠绒毛收集,由于受到该疾病的特殊性影响,急诊病患以及入院第二天即要求手术的病患,无法收集到足够的病情影响因子,未能予以辨病分期、辨证分型及影响因子评分,故仅能以未使用药物治疗作为收集对象的纳入标准。
(7)本研究观察的是活血化瘀消癥杀胚复方宫外孕I号方加减的作用机理,对于该方内各个单药的药物机理及各个药物各自的作用机制有待于进一步研究。
2.展望
(1)目前临床缺乏疗效显著的杀胚中药,直接影响了治疗异位妊娠的近期疗效。继续进行中医药文献和科研及临床研究,寻找和挖掘杀胚效果显著的中药,更加优化杀胚处方,提高疗效。
(2)在临床治疗过程中,开展对有生育要求的异位妊娠患者的远期疗效监测和随访,优化关于改善输卵管功能、减少远期并发症的处方和各种中医药治疗措施,减少不孕和再次异位妊娠的发生率,充分体现中医中药治疗异位妊娠的优势。
(3)实验研究可进一步深入探讨中医药对输卵管妊娠的作用机制,运用指纹图谱-质谱联合等手段阐明中药起效的成分,进而探寻中药复方的作用靶点及对整体的调节机制。


参考文献    略

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