化瘀消癥杀胚中药对异位妊娠裸鼠体内模型的影响及临床治疗的研究

作者:徐娟|邓高丕
2015-4-22 阅读

摘    要

  异位妊娠是指胚胎植入子宫体腔以外的部位,其中98%发生在输卵管[1]。在西方国家,异位妊娠约占妊娠总数的1.5-2%[2],在发展中国家其发生率甚至更高[3]。作为具有高度危险的妊娠早期并发症,异位妊娠是孕产妇在妊娠期前3个月死亡的主要原因之一[1]。
  经过多年研究,异位妊娠的一些危险因素已经确定,其中包括:盆腔炎症感染、吸烟、子宫内膜异位症、既往手术史、体外受精技术[4、5]。近年来,研究者们已在组织学、细胞形态学乃至分子生物学等各个层次对异位妊娠的机制做了大量研究,然而,迄今很大程度上是基于体外研究,因为很少有发生输卵管妊娠的动物[4],阻碍了异位妊娠的实验研究。

1.实验研究

目的:
  本实验通过绒毛组织块移植法建立人源妊娠绒毛组织块裸鼠体内移植模型,弥补异位妊娠缺少有效的体内动物模型的空白。并观察化瘀消癥杀胚中药干预后的绒毛组织的形态学改变及相关分子基因的表达,探讨化瘀消癥杀胚中药(宫外孕Ⅰ号方加味)对异位妊娠滋养细胞的作用机制,为后期进一步研究化瘀消癥杀胚中药复方的药效物质基础及新药开发奠定基础。
研究方法:
  通过人源绒毛组织块移植法构建异位妊娠裸鼠体内动物模型,并以裸鼠体内移植模型为研究载体,并随机分为中药组(12只)、西药组(12只)、阴性组(12只),中药组予化瘀消癥杀胚中药灌胃7天,西药组予观察第1天肌注甲氨蝶呤,阴性组予纯净水灌胃7天。检测指标:
(1)裸鼠模型一般生长情况,包块情况,给药前后测小鼠绒毛膜促性腺激素(CG)。
(2)采用光镜、免疫组化观察干预后的绒毛滋养细胞的组织结构的影响。
(3)采用qRT-PCR检测雌、孕激素受体及基质金属蛋白酶的表达。
(4)Western-blot检测细胞凋亡相关基因Bax、Bcl/2的表达。
研究结果:
(1)裸鼠一般生长情况:精神状态良好、活动力、反应力未见异常,无恶心、呕吐、腹泻等症状,无死亡。摄食量、饮水量、体重未见明显差异(P>0.05)。给药前后小鼠绒毛膜促性腺激素(CG)值比较无统计学差异(P>0.05)。
(2)给药后移植包块缩小,三组间差异无统计学差异(P>0.05)。
(3)给药后,中药组和西药组的ER、PR表达量较阴性组均明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05),而西药组与中药组的ER、PR相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。MMP2的表达量三组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。
(4)给药后,各组动物Bcl-2和Bax的灰度值比较,差异均无统计学意义(P>0.05);而中药组Bax灰度值的均值明显高于西药组和阴性组。
2.临床研究
目的:
  结合前期输卵管妊娠的中西医结合诊疗方案的研究,通过前瞻性、随机对照研究观察,评价原制定的“中西医结合输卵管妊娠治疗方案”的正确性和可行性,深化和完善输卵管妊娠的系列研究。
研究方法:
  选择2010年5月至2012年2月输卵管妊娠病例,进行辨病分期、辨证分型和计算病情影响因子总积分后,确定可以进行“中西医结合”药物保守治疗的病例,按不等随机对照试验(2:1),将病例分为观察组和对照组。观察组按照“输卵管妊娠中西医结合治疗方案”中的中西医结合方法治疗,对照组用米非司酮治疗。通过对比两组间的有效率、有效病例的腹痛消失时间、阴道流血停止时间、血β-HCG值下降时间、包块缩小情况,探讨中西医结合治疗输卵管妊娠的优势及可行性。
研究结果:
(1)纳入病例情况:根据诊断标准、纳入标准及排除标准,2010年5月至2012年2月共收集符合中西医结合药物保守治疗的输卵管妊娠病例70例,观察组(中西医)46例,对照组(西医)24例。
(2)病情影响因子情况
70例病例中,25-29岁年龄段所占比例最高,占48.57%;孕3次者所占比例最多,占32.86%;产0者居多,占50.00%;停经天数为43-56天所占比例最高,占64.28%;腹痛症状表现为隐痛者所占比例最多,占70.00%;B超下包块最大径3-5cm者所占比例最高,占54.29%;B超下出血最大径<3cm者所占比例最高,占75.71%;初始血β-HCG值在1000-3000IU/L之间者所占比例最高,占67.14%;病情影响因子总积分,观察组为8.59±0.93分,对照组为8.33±0.87分。
使用t检验与秩和检验,观察组和对照组在年龄、孕产次、停经时间、腹痛情况、B超下包块最大径、B超下出血最大径、初始血β-HCG值和病情影响因子比较,差异无统计学意义(P>0.05),两组具有可比性。
(3)疗效研究结果:观察组有效率为89.13%;对照组有效率为70.83%,两组疗效比较差异有统计学意义(P<0.05);观察组腹痛消失时间为4.23±2.52天,对照组为4.40±1.45天,两组比较差异无统计学意义(P>0.05);观察组阴道流血停止时间为5.95±4.05天,对照组为6.06±3.21天,两组比较差异无统计学意义(P>0.05);观察组血β-HCG值下降至50%的时间为11.29±5.19天,下降至10%的时间为20.34±6.22天,对照组分别为11.47±5.03天,21.47±8.92天,两组比较差异均无统计学意义(P>0.05);观察组包块缩小率为86.96%,对照组为58.33%,两组比较差异有显著性统计学意义(P<0.01)。
3.研究结论
(1)本研究运用人源绒毛组织块移植法成功地建立了异位妊娠裸鼠体内移植模型,具有成模率高、操作方便、种植后滋养细胞活性持续时间长等优势,填补了异位妊娠动物体内移植模型的空白,能为进一步的发病机制、药效物质基础等研究提供有效的研究载体。
(2)本研究采用qRT-PCR技术,发现化瘀消癥杀胚中药能够下调ER、PR表达,从而拮抗雌孕激素,引起绒毛组织变性、坏死。从分子水平阐述了化瘀消癥杀胚中药对异位妊娠影响的可能调控机制。
(3)本研究采用western-blot技术,发现化瘀消癥杀胚中药有明显上调Bax蛋白表达的趋势,从而促进细胞凋亡,促进绒毛组织坏死。从基因水平阐述了化瘀消癥杀胚中药对异位妊娠影响的可能调控机制。
(4)临床研究通过与纯西药组相比较,证实符合中西医保守治疗的输卵管妊娠患者,依照“输卵管妊娠中西医结合治疗方案”进行治疗,疗效切实,治疗成功率较高,特别是中医药在促进盆腔包块缩小方面有较大优势,有利于输卵管功能的恢复。

关键词:化瘀消癥杀胚中药;异位妊娠;裸鼠体内移植模型;中西医结合治疗方案

引    言

  异位妊娠是指受精卵在子宫体腔以外部位的着床,习称“宫外孕”,而其中输卵管妊娠约占98%[1],近年来,盆腔炎、流产、体外受精患者的增多,发病率有上升趋势,目前仍是孕产妇在妊娠期前3个月死亡的主要原因之一[1]。随着超声诊断、生化检测等技术的发展,医生和患者对本病重视程度的提高,异位妊娠的早期诊断率已大大提高,降低了孕妇的病死率,也为早期的非手术治疗提供了有利条件,使部分患者避免了手术痛苦及风险,减少了术后并发症,为要求生育的患者提供了更多受孕的可能。
  目前,研究者们已在组织学、细胞形态学乃至分子生物学等各个层次对异位妊娠做了大量研究。然而迄今为止,实验研究大部分依赖体外模型,尚缺乏异位妊娠的动物体内模型,难以呈现异位妊娠的关键病理环节;而中医药对异位妊娠的研究多处在血液流变学的水平,深入、系统地探讨中医药对异位妊娠的调控机制的研究较少。
  针对以上现状,本研究通过人源妊娠绒毛组织块移植法建立裸鼠体内移植模型,并观察化瘀消癥杀胚中药干预后的绒毛组织的形态学改变及相关基因的表达,探讨化瘀消癥杀胚中药对异位妊娠滋养细胞的作用机制,为后期进一步研究化瘀消癥杀胚中药的药效物质基础及新药开发奠定基础。
  临床研究部分则在导师课题组前期确立的新输卵管妊娠中医辨证分型体系及 “输卵管妊娠中西医结合治疗方案”的基础上,通过前瞻性、不等随机对照研究,纳入符合“中西医结合保守治疗”的患者,并设立西药对照组,探讨按照新输卵管妊娠中医辨证分型体系及“输卵管妊娠中西医结合治疗方案”进行异位妊娠诊治的可行性、科学性和有效性,进一步深入、完善异位妊娠的系列研究。

第一章  文献研究

第一节 西医对异位妊娠的研究进展
  异位妊娠是妇产科常见的急腹症,其中输卵管妊娠最为常见,约占98%,是孕产妇妊娠早期的主要死亡原因之一[1]。经过多年研究,一些异位妊娠的危险因素已经确定,其中包括:盆腔炎症感染、吸烟、子宫内膜异位症、既往手术史、体外受精[4、5]近年来,研究者们已在组织学、细胞形态学乃至分子生物学等各个层次对异位妊娠做了大量研究。诊断技术的发展、对疾病重视程度的提高,使得异位妊娠的早期诊断率大大提高,降低了孕妇的病死率,也为早期的非手术治疗提供了有利条件,为要求生育的患者提供了更多受孕的可能。
一、异位妊娠发病机制的研究进展
(一)相关调控因子的研究
  输卵管炎症损害引起输卵管不通畅,导致胚泡滞留被认为是异位妊娠的主要原因,然而,滞留的胚泡必须完成“着床”的关键步骤。在妊娠生理中,子宫内膜对胚胎的容受性是妊娠建立的关键因素之一,在每个有排卵的月经周期中仅在极短的时期内才允许胚泡植入,称为“着床窗”,此时子宫内膜表现出最大的胚泡种植容受性,且受性激素及其受体、细胞因子、蛋白分子、酶类、转录因子等的调控[6、7、8]。而越来越多的研究显示,类似于子宫内膜的“种植窗”,输卵管亦具有适宜于胚泡着床的结构,并可表达“着床窗口”期一些特异分子,可能参与调控异位妊娠时胚泡的着床[9、10]。
1.雌激素受体(estrogen receptor,ER):雌激素与其受体结合后调节特殊基因表达,刺激雌性生殖道及相关器官的生长和分化。输卵管的ER主要定位基质和上皮分泌细胞的细胞核中,其表达呈增殖期增高,分泌期下降[11]。Shao等[12]通过动物实验发现了ERα对输卵管蛋白合成和分泌液形成的调节机制,参与卵泡发育和早期胚胎发育,提示ERα对妊娠的成功有着重要意义。Horne等[13]研究发现,输卵管妊娠妇女的输卵管中缺乏ERα蛋白,而其正常存在于行子宫切除术和正常月经周期妇女的输卵管中。
2.孕激素受体(progestin receptor,PR):孕激素通过两种核受体亚型PR-A、PR-B的介导调节特异基因表达,对卵泡发育、子宫内膜容受性、妊娠维持及附属器官的发育和分化具有重要的作用。PR主要定位输卵管上皮分泌细胞、基质细胞和肌细胞的核中,在月经周期的中期和分泌期可观察到强阳性信号[11],在子宫内膜的蜕膜化反应中通过调节其特异基因和细胞功能而起作用[14]。有较多研究发现,输卵管妊娠患者的输卵管中缺乏PR蛋白表达,而正常存在于未妊娠黄体中期妇女的输卵管中[13、15]。
3.细胞外基质(extracellular matrix,ECM):具有丰富而活跃的生物学功能,参与细胞内外信号的传递,调节特异基因的表达,对调节胚胎发育进程、决定细胞的粘附特性及迁移方向具有重要的作用。ECM主要分为四类:胶原、非胶原糖蛋白、氨基聚糖与蛋白聚糖、以及弹性蛋白。除弹性蛋白外,其它三类都是由结构和功能相关的多种成员构成的大家族。如糖蛋白包括纤粘连蛋白(FN)、层粘连蛋白(LN)等。这些基质蛋白分子可以互相结合作用,保证组织的稳定性及细胞的正常生理功能。Kemp等[16]研究发现在输卵管妊娠中,绒毛间质、滋养层细胞柱远端、浸润性绒毛外滋养细胞以及血管内滋养细胞中均可检测到FN,在浸润位点,FN分布于浸润性滋养层细胞的外周,可能增强了其对母体界面的粘附,便于细胞的浸润。LN的表达定位与FN 相类似。并且推测,与正常妊娠相比,输卵管妊娠6-10周浸润性滋养层细胞表达的ECM与其整合素受体不匹配,可能是输卵管妊娠的着床胚胎后期不能正常发育的原因之一。国内相关研究发现,FN在正常输卵管峡部、壶腹部和伞部粘膜上皮未见表达,在近妊娠部位的输卵管粘膜上皮也未见表达,提示这可能是正常情况下抑制和避免早期胚胎在输卵管植入的机制之一。但是,输卵管基底膜和基质表达FN,表明输卵管内也具备胚胎植入的基础;另一方面,FN在妊娠部位输卵管的粘膜基质和基底膜的表达显著高于分泌期正常输卵管的表达,提示在异常情况下(如炎症等)使输卵管上皮组织学改变,FN有可能参与了介导滞留胚胎在输卵管的粘附和侵入[17]。
4.基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs):是一种几乎能降解ECM中各种蛋白成分的酶,广泛分布于人体各种组织和器官,破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障,在肿瘤侵袭转移中起关键性作用。目前MMPs家族已分离鉴别出26个成员,编号分别为MMP1~26,当前对MMP-2的研究较深入。Kucera等[18]对破裂与非破裂输卵管妊娠的标本进行研究,结果表明MMP-1、MMP-2及TIMP-2参与异位妊娠的早期植入。Qiu X等[19]研究发现,在输卵管妊娠着床点,基质金属蛋白酶的表达随着滋养层细胞的浸润深度而增加,反之其抑制因子TIMP-1和TIMP-2的表达减弱。基质金属蛋白酶和蛋白酶抑制剂在异位植入部位的不平衡表达可能会导致广泛的细胞外基质的降解。梁琴等[20]运用免疫组化结合病理图像半定量分析方法检测正常输卵管壶腹部标本(A组)、输卵管炎壶腹部标本(B组)、输卵管壶腹部妊娠标本(C组)中MT1-MMP、MMP-2 及 TIMP-2 的表达情况,结果发现,TIMP-2的表达在A组输卵管黏膜中最高,B、C 组间比较无差异。TIMP-2表达强度与MMP-2,MT1-MMP相反,A 组最低,B组的表达最高,C组的表达略低于B组。因此推测输卵管的慢性炎症会引起 MMP-2的激动剂 MT1-MMP 表达增强,MMP-2/TIMP-2 之间的动态平衡失衡,从而可能参与了输卵管妊娠的发生。而晏长荣等[21]通过检测输卵管妊娠黏膜组织、正常输卵管黏膜组织及正常宫内早孕组子宫蜕膜组织中MMP-2及TIMP-2的表达,发现MMP-2和TIMP-2阳性表达均在正常宫内早孕组最高,在输卵管妊娠组中较高,在正常输卵管组中最低。说明在输卵管妊娠时较高水平的MMP-2促进输卵管黏膜ECM降解,使细胞间连接疏松,有利于绒毛滋养层细胞穿透母体输卵管黏膜,TIMP-2伴随MMP-2也呈较高水平表达,拮抗MMP-2对ECM的降解作用,避免滋养层细胞对输卵管黏膜的过度侵袭,两者形成动态平衡,使得胚胎成功着床于输卵管黏膜。
5.人输卵管特异性糖蛋白(human oviduct specific glycoprotein,hOGP):由人输卵管上皮分泌细胞合成分泌的一种蛋白质,与血清中雌、孕激素和黄体生成素水平有关,可能在促进受精及早期胚胎发育中起作用。有研究显示[22],hOGP在卵透明带上有特定的结合位点,高度糖基化的输卵管糖蛋白通过与卵透明带、早期胚胎及输卵管上皮细胞结合,防止胚胎滋养层对输卵管壁的粘附,保证早期胚胎在输卵管中活动自如。
(二)细胞凋亡及调控基因Bax/Bcl-2与异位妊娠的关系
  细胞凋亡(apoptosis)又称程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD),参与机体细胞生长与更新的调节。胎盘组织中滋养细胞适量增生、分化与凋亡,对维持正常妊娠至关重要,细胞凋亡受自身基因的调控,Bcl-2基因蛋白家族在细胞凋亡通路中起着重要的调节作用。Bcl-2家族是一类新的癌基因家族, 根据其功能不同分为二类[23] ,一类是抗凋亡蛋白,代表基因是Bcl-2;另一类是促凋亡蛋白,代表者是 Bax。
  Rango等[24]研究表明,在输卵管妊娠时,Bcl-2表达量升高,细胞凋亡诱导失败,可能会导致不受控制的入侵和渗透的输卵管壁,这可能是由于植入位点免疫微环境不同,导致滋养细胞自分泌因素和母体旁分泌因素的失调,进而影响了滋养细胞现在的侵袭活性与自我凋亡的调节能力。
  Kucera[25]等通过免疫组化发现,与非破裂型输卵管妊娠相比,输卵管妊娠破裂型的Bcl-2阳性染色带范围及强度均更高,提示异位妊娠的滋养细胞向输卵管壁肌层侵袭,最终导致输卵管破裂,可能是由于正常的细胞凋亡调控失衡。认为Bcl-2的表达升高反映了输卵管滋养层细胞的过度增殖,Bcl-2可以作为预测输卵管妊娠破裂的一项新指标。
二、西医对异位妊娠治疗的研究进展
  目前治疗异位妊娠的西药有甲氨蝶呤(MTX)、米非司酮(RU486)、5-氟脲嘧啶(5-Fu)、氯化钾、高渗葡萄糖等,其中最常用的是前3种。
(一)甲氨蝶呤(MTX)
  MTX是一种有效的叶酸拮抗剂,通过抑制双氢叶酸还原酶而使二氢叶酸不能还原成有生理活性的四氢叶酸,导致嘌呤和嘧啶的合成被抑制,干扰DNA的生物合成,从而起到破坏绒毛,使胚胎组织坏死、脱落、吸收[26]。周萍等[27]用MTX治疗132例异位妊娠患者,其中A组66例采用肌肉注射MTX 20mg,1次/d,连续用药5d为一疗程,B组66例采用MTX 50mg/m2单次肌肉注射。A组治愈52例,成功率78.79%,14例失败,改为手术,失败率为21.21%。B组治愈60例,成功90.91%,6例失败。
(二)米非司酮(RU486)
  RU486是1980年由法国Roussel-Uelaf公司的Philibert研究开发出的抗孕激素,是一种19-去甲睾酮的衍生物,能与孕酮受体及糖皮质激素受体结合,从而产生较强的抗孕酮作用,使妊娠的绒毛组织及蜕膜组织变性,内源性的前列腺素释放,促使黄体生成素(LH)下降,黄体溶解,从而使依赖黄体发育的胚囊坏死产生流产。国内多数报道[28、29、30]认为RU486可以减少蜕膜中孕激素受体,而部分研究[31、32]认为提示服用RU486后,孕激素受体的制造较活跃,而因为在孕激素受体拮抗剂RU486的存在下,放免测定会低估受体蛋白水平而表现为PR浓度降低。较多研究显示[33、34],RU486可明显降低人早孕期绒毛滋养细胞中血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素(Ang-1)表达,造成绒毛血管及间质血管形成发生障碍,进而不利于胚胎生存。此外,越来越多的学者[35、36]认为RU486通过诱导并促进早孕蜕膜细胞凋亡来实现使蜕膜变性坏死的过程,从而达到终止妊娠的作用。国内外较多研究显示使用RU486联合MTX或中药治疗异位妊娠较单用效果佳,也有报道显示[37]RU486与MTX 在治疗异位妊娠的治愈率、β-HCG转阴时间上差异无显著性,但MTX副作用多。张国华[38]用米非司酮600 mg(100mg/12h,连服3天),治疗异位妊娠14例,治愈率71.4%。雷六春[39]观察了米非司酮治疗异位妊娠的患者167例,予口服米非司酮100mg,q12h,连续3天,治疗结果为治愈122例,占73%,失败45例,占27%。其中失败改手术者32例,占19%,重复米非司酮第二疗程成功13例,占7.8%。从蓉俊[40]用甲氨蝶呤联合米非司酮治疗异位妊娠36例(MTX 20 mg肌注,qd,连用 5d;同时米非司酮 50 mg口服,bid,连用3d),治愈 29 例,其中 12 例治疗2个疗程,治愈率为80.6%;7例无效病例中,1例破裂行急诊手术,5例因血β-HCG 持续升高而改行手术治疗,1例因出现较重的副反应而放弃保守治疗。屈莉红等[41]对29例输卵管妊娠给予米非司酮150 mg/d口服,3天1个疗程;并于服药第1天肌注甲氨蝶呤1 mg/kg或50 mg/m2,观察用药后生命体征、腹痛、阴道出血、血β-HCG下降情况及药物的毒副作用。结果为27例患者保守治疗成功,治愈率达93.1%,1例失败行患侧输卵管切除术,1例卵巢黄体破裂手术治疗。
(三)5-氟脲嘧啶(5-Fu)
  5-Fu是一种滋养细胞高度敏感的化疗药物,通过抑制脱氧胸苷酸合成酶,阻止脱氧尿苷酸(dUMP)甲基化转变为脱氧胸苷酸(dTMP),从而影响DNA的合成,致使滋养细胞死亡,妊娠时滋养细胞处于增殖状态,对5-FU更敏感[42]。此外,5-FU 在体内可转化为5-氟尿嘧啶核苷,以伪代谢产物形式掺入RNA中干扰蛋白质的合成,故对其他各期细胞也有作用。关于5-Fu的用法和用量文献报道不一,可用10 mg/(kg?d),静脉点滴,6-8d为1个疗程,也可1 g/d,静脉点滴,5 d 为1个疗程,还可宫腔镜下输卵管注入250 mg/次[43]。邹烨[44]用5-Fu和米非司酮联合治疗异位妊娠68例,观察组给予米非司酮300m一次顿服,5-Fu 1g/d,静脉滴注,连用3d;对照组单用5-Fu,结果发现5-Fu和米非司酮联合治疗的成功率为89.47%,明显高于对照组。观察治疗期间的病情变化,发现疗效与血β-HCG水平、有无心管搏动有关。
(四)其他
  其他药物如环磷酞胺、氯化钾、高渗葡萄糖等大多采用局部用药,临床使用不方便,现多被MTX、RU486等药物所取代。
第二节 异位妊娠的中医药研究进展
一、中医病因病机
  中医古籍没有宫外孕的病名,从《中国医学百科全书?中医妇科学》始,中医已通用“异位妊娠”或“宫外孕”之病名。中医学认为输卵管妊娠的本质是少腹血瘀之实证。而其病因主要有:或因宿有少腹瘀滞,胞脉胞络不畅,使孕卵运行受阻,不能移至宫腔;或因先天肾气不足,冲任虚弱,后天脾气受损,以致输送孕卵迟缓乏力,孕卵停滞于宫腔之外,影响了胞脉、胞络血气调畅和胚胎自身的发育,脉络破损,血溢于内,离经之血或离宫之胚溢于少腹,便形成少腹血瘀之证,若阴血暴亡,气随血脱,则变生厥脱之危急重证,或瘀积日久不散,发为少腹血瘀之癥瘕[45]。
二、辨证分型
  根据异位妊娠疾病的发展规律,临床上常分为“未破损期”和“已破损期”,其中,“已破损期”又辨证分为的“休克型”、“不稳定型”和“包块型”。虽然目前教材中关于“异位妊娠”的辨证分型指出了病情发展不同阶段的临床特征,但无法体现不同阶段的主要中医病机特点。导师邓高丕教授带领的课题组,根据中医理论与临床实践,确立了新的输卵管妊娠的中医辨证分型体系,归纳总结为未破损期的胎元阻络、胎瘀阻滞与已破损期的气血亏脱、正虚血瘀和瘀结成癥五型。从2004年1月开始,课题组应用“输卵管妊娠的中西医结合诊疗方案”至今,临床治疗了1000多例输卵管妊娠的患者,其中药物治疗成功率达到88.9%以上[46],有效地指导临床医生根据输卵管妊娠的不同情况选择较佳的治疗方案,避免了治疗手段的太过或不及,使患者避免了因手术而承受的痛苦,减少了术后并发症,同时最大限度保全了患者的生育功能,并节约了医疗资源。该课题研究已经纳入国家科技部中医药科技专项研究。
三、中医药治疗研究进展
(一)中药复方的研究
  针对输卵管妊娠的少腹血瘀实证的病机本质,临床治以活血化瘀消癥杀胚,代表方剂有宫外孕Ⅰ号、Ⅱ号等。黄少妮等[47]对35例早期未破裂型低HCG(β- HCG<1000IU/ L) 异位妊娠患者运用宫外孕Ⅱ号方加减三步骤保守治疗。疾病初始时,以杀胚、降β-HCG为主;β-HCG明显下降,阴道出血量多,或阴道出血时间较长、淋漓不尽时,以止血佐活血化瘀为治则;β-HCG已正常或将近正常,但附件包块仍存在者,以活血化瘀消癥为法。治疗结果:痊愈9例,有效23 例,无效3 例,总有效率为91.43%。李道成等[48]观察腹腔镜下保守手术后应用宫外孕Ⅱ号方加味预防持续性异位妊振(PEP)的临床疗效,研究依据治疗方式不同将患者分为A组(52例):手术+术中向患侧输卵管系膜内注射甲氨蝶呤(MTX)20mg;B组(49例):手术+术后宫外孕Ⅱ方加味治疗;C组(41例):单纯手术。研究结果表明A、B、C组的PEP发生率分别为1.9%、2.0%、12.2%,A、B两组的发生率明显低于C组(P<0.05),且A、B两组的手术后72小时的血清β- HCG下降幅度明显大于C组(P<0.05),术后β- HCG恢复到正常的时间明显比C组短(P<0.05),而A组的治疗后副反应明显高于B组(P<0.05)。方开英[49]运用米非司酮配伍宫外孕Ⅰ号方加味及宫外孕Ⅱ号方加味治疗异位妊娠60例,疗程2-4 周,治愈51 例,治愈率85%,9 例因腹痛加重,有活动性内出血放弃保守治疗改手术治疗。部分患者服用米非司酮有头晕、恶心、乏力,症状轻,少数患者服用宫外孕Ⅰ号方加味、宫外孕Ⅱ号方加味有轻度白细胞降低。
(二)化瘀消癥杀胚中药的研究
  异位妊娠的治疗药物多具有活血化瘀、消癥、杀胚之功效,而药物对胚胎的杀灭作用对异位妊娠治疗成功与否有重大关系。目前文献研究较多的有以下几味:
  紫草:有凉血活血,解毒透疹之功[50],主要成分为萘醌类色素、脂肪酸和多糖[51]。能够降低血清促卵泡激素(FSH) 和黄体生成素(LH) 水平,从而抑制卵泡的发育和成熟,并有阻断绒毛膜促性腺激素(HCG)的作用,从而破坏绒毛生长,阻碍妊娠黄体发育,起到辅助终止妊娠的作用[52]。王丽君[53]等发现大鼠口服紫草总酚酸720 mg?kg-1能够显著性提高米非司酮( 8.0 mg?kg-1 ) 的妊娠抑制率( P<0.05) ,并增加实验组平均死胎数。对雌二醇和睾酮无明显影响,说明其抗早孕作用不是通过升高雌二醇或降低孕酮水平来实现。王姝[54]等采用紫草联合甲氨蝶呤治疗宫外孕96例,与单用甲氨蝶呤治疗宫外孕100例对照观察,发现联合组(A组)疗效明显优于单用甲氨蝶呤治疗组(B组)。在治疗过程中,A组副作用发生率与B组差异无统计学意义,未增加副反应,A组住院天数明显少于B组。李欣[55]等用复方紫草汤联合甲氨蝶呤、米非司酮保守治疗异位妊娠40例,与单纯西药治疗宫外孕196例对照观察,下降50%、转阴性时间以及盆腔包块消失时间均显著缩短,疗效满意。
  天花粉:具有清热生津,消肿排脓之效,其主要成分为蛋白质、植物凝血素、多糖、酶等[50],现代药理研究表明,天花粉蛋白(TCS)有致流产和抗早孕作用。其机理是:引起绒毛合体滋养层细胞发生广泛变性坏死,纤维素沉着,绒毛间隙闭塞,阻断血循环,血循环阻断又加速绒毛的变性坏死,促使前列腺素释放而导致流产[56]。陈勤[57]应用天花粉蛋白注射液保守治疗输卵管妊娠,研究组(160例)采用天花粉蛋白注射液治疗,对照组(160例)采用甲氨蝶呤配伍米非司酮治疗。研究组治疗成功 131例(81.9%),对照组 128例(80.0%),两组治疗成功率比较差异无统计学意义(P>0. 05) 。而研究组发生副反应 57例(35.6%),其中肝功能损害35例,发热18例。对照组副反应发生81例(50.6%),其中胃肠道反应39例,骨髓抑制27例,肝功能损害15例。两组比较副反应发生率差异有统计学意义(P<0.05) 。高金珠[58]用紫草、天花粉等中药组方,治疗非破裂型异位妊娠24 例,22 例成功,成功率为91.67%。
  山西医学院第一附属医院使用的宫外孕Ⅰ号、Ⅱ号方以丹参、赤芍、桃仁以主药。①丹参,有活血调经,凉血消痈之效,《神农本草经》称其能“破癥除瘕”。现代研究发现其主要含丹参酮Ⅰ、隐丹参酮等多种醌类,尚含丹参素、丹参酸甲、乙、丙以及儿茶酸等[50]。具有抗凝、促纤溶、扩血管、改善微循环、促进组织修复、诱导肿瘤细胞凋亡等作用[59]。②桃仁,有活血祛瘀、润肠通便、止咳平喘的功效,《神农本草经》称其“主瘀血,血闭 ,瘕,邪气,小虫”,主要成分含脂质体、甾体、黄酮及糖类[50]。其药理作用主要包括抗凝血、抗炎、提高免疫力、抗肿瘤等[60]。③赤芍,清热凉血、祛瘀止痛之品,《神农本草经》谓其能“除血痹,破坚结,寒热疝瘕,止痛”。主要含有芍药苷、芍药内酯苷、氧化芍药苷、芍药吉酮等[50]。现代药理发现其有抗凝、抗血栓、抗肿瘤等作用。秦文平[61]等应用宫外孕方联合甲氨蝶呤及米非司酮治疗输卵管妊娠68例,对照组用甲氨蝶呤及米非司酮治疗,治疗组在治疗成功率、血β-HCG下降情况、转阴时间、盆腔包块缩小率及平均住院日均优于对照组,差异比较均有统计学意义(P<0. 05)。
  目前中医药治疗输卵管妊娠主要的研究多处于血液流变学的水平,利用化瘀消癥杀胚中药抗凝、抗血栓等作用改善局部血液循环,影响妊娠输卵管粘膜细胞的生理代谢过程的正常进行,促进胚胎组织凋亡,能减少胶原纤维合成,提高纤溶酶活性,使机化组织变软,利于血肿与妊娠物的吸收。然而,化瘀消癥杀胚中药更具体的细胞调控机制及药效物质基础有待进一步的研究。
第三节 异位妊娠的实验模型研究
  国内外对于异位妊娠的实验研究对象比较局限,大部分实验模型研究依赖体外模型,主要有以下三类模型:
一、人源标本
  由于伦理问题,无法收集正常妊娠孕妇的输卵管标本与异位妊娠的输卵管标本进行对比研究。已有的人体内标本来源多是需行子宫切除的非妊娠患者的输卵管标本,与异位妊娠的输卵管标本进行相关基因、蛋白组学的比较研究[13、62],也有研究对需行子宫切除的非妊娠患者术前注射HCG,模拟高孕酮水平、子宫内膜蜕膜化等假孕状态,从而比较这些患者输卵管与异位妊娠组输卵管的蛋白表达差异[63、64],但是其在安全性与模型的有效性方面仍有争议。
二、体外模型
  人类滋养细胞是极为特殊的细胞,源于胚胎的胚外层。具有合成、分泌与妊娠有关的多种物质,如:胎盘生乳素(hPL)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)等,在妊娠的维持中有重要作用。滋养细胞具有侵润性,其浸润机制与恶性肿瘤有一定程度上的相似,包括蛋白酶水解、周围基质降解、组织重建等。与恶性肿瘤不同的是,种植部位中间滋养细胞的浸润有严格的调控机制,其侵润行为限制在种植部位浅层及妊娠的早期阶段,一般发生在妊娠的前3个月[65]。目前人绒毛滋养层细胞体外培养用于妇产科、生殖医学、分于生物学等多种研究领域。课题组前期实验已体外培养了输卵管妊娠部位滋养层细胞,并用化瘀消癥杀胚复方的大鼠含药血清对其进行干预,发现化瘀消癥杀胚复方能诱导输卵管妊娠滋养细胞凋亡,揭示了化瘀消癥杀胚复方杀胚作用机制之一[66]。
  输卵管上皮细胞的研究比较有限,这可能与以下几点有关:1、输卵管上皮细胞输卵管细胞培养的标本不易获得;2、输卵管上皮细胞的分离过程比较困难,据报道,目前仅建立了两种输卵管上皮细胞系[67、68] ;3、培养后失去了原位细胞相关的功能,如纤毛。然而,输卵管体外模型在异位妊娠某些研究方面有较大价值,如输卵管妊娠相关危险因素(如吸烟、盆腔炎等)对输卵管基因表达、信号通路作用,宫内妊娠与异位妊娠基因表达差异等等。
三、动物模型
  有异于灵长类动物,其他动物发生异位妊娠多为腹腔妊娠,与灵长类异位妊娠的治疗、预后均不相同。目前报道的灵长类动物异位妊娠仅有3例[69、70]。近年来,啮齿目动物模型的研究有较多的进展。
  Wang等[71]研究发现,大麻素受体CB1 基因沉默导致了大量的胚胎在小鼠输卵管的保留,最终导致妊娠失败,在野生型小鼠中也观察到,毒品甲安菲他明能减缓输卵管对胚胎的运输作用,这些研究结果表明,大麻素信号传导异常可以导致输卵管平滑肌的收缩和放松失调影响输卵管运输功能,而CB1和β2-肾上腺素受体在输卵管肌层的共位点意味着一个内源性大麻素与肾上腺素受体协调合作维持输卵管蠕动正常,使受精卵正常输送至宫腔。由于前期的研究显示,CB1不足会影响妊娠,wang等[72]建立了敲除CB1受体基因与CB2受体基因的小鼠模型,并发现不同于CB1缺失的小鼠,CB2受体基因敲除小鼠的输卵管运输功能正常。
  为了模拟人生殖道衣原体感染引起输卵管损害的病理过程,雌性鼠类也常常被用来建立生殖道衣原体感染模型。衣原体感染引起的输卵管病理变化包括上皮细胞扁平化、输卵管扩张、输卵管纤维化、峡部阻塞、壶腹部积水形成等[73、74、75、76]。
四、异位妊娠裸鼠体内移植模型探讨
  裸鼠是1966年发现并培育的一种小鼠突变株,其先天无毛、无胸腺,T淋巴细胞功能缺乏,对异种移植物不产生排斥反应,异种移植后的人体肿瘤在裸鼠体内仍保持其原有的组织形态、免疫学特点、特有的染色体组型以及对抗癌药和电离辐射等原有特性。正是由于免疫缺陷,它可用来进行异种动物组织移植,是免疫、肿瘤等方面研究的良好实验模型动物,被誉为活的试管。目前,在肝癌、胃癌、肺癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌等癌症研究方面国内外都开展了大量的研究工作,这些肿瘤移植于裸小鼠后,能保持原有生物学特征[77]。移植性模型是研究疾病病因和筛选新药中最常用的模型。
  目前裸鼠移植瘤的移植部位常选择腹(胸)腔移植和原位移植。腹(胸)腔部位的移植操作方法简单,潜伏期短。原位移植则是将人体细胞移植于裸鼠的相应器官,此种模型与人体肿瘤的生物学特性最接近,但操作过程相对复杂。
  移植后瘤体是否成功受多种因素影响,比如①细胞来源:直接来自原发组织或培养传代的细胞。②接种细胞的状态。 ③肿瘤细胞的浓度和数量:裸鼠成瘤时细胞用量较大。一般认为皮下注射的细胞浓度应在1×107/ml以上,接种到皮下的细胞数应在1×106个以上。④微生物学控制:饲养在GF和SPF条件下的裸鼠比普通环境中的裸鼠更宜于细胞侵袭生长。
  那么,能否利用裸鼠对异种移植物不排斥、滋养细胞或绒毛组织块的浸润行为来建立异位妊娠裸鼠移植模型值得探讨。
  综上,目前国内外对异位妊娠的研究存在不足主要表现:
(1)有关异位妊娠动物模型国内外尚没有稳定的、能够反映关键病理变化地模型,国外这方面起步早,但多根据单因素建立的,国内有关研究也是多复制同行研究的基础。
(2)临床研究多,深入系统的研究较少。
(3)滋养细胞及其侵袭环境必定有其异常表达的基础,既往临床和实验研究多着眼于某一方面的变化,不能全面发现,进一步弄清其中的具体调控机制将有可能解开输卵管妊娠的决定因素之谜。
第二章  实验部分
  目前异位妊娠的实验研究载体主要依赖体外模型,迄今为止国内外尚没有稳定的、能够反映异位妊娠关键病理变化的模型。本实验采用人源绒毛组织块移植法建立异位妊娠裸鼠体内移植模型,弥补异位妊娠缺少有效的体内动物模型的空白,并探讨化瘀消癥杀胚中药对早期异位妊娠滋养细胞的调控机制作用,为后期进一步研究化瘀消癥杀胚中药的药效物质基础及新药开发奠定基础。
第一节 裸鼠体内移植模型的建立
一、研究目的与内容
  采用人源绒毛组织块移植法建立异位妊娠裸鼠体内移植模型,为进一步化瘀消癥杀胚中药对异位妊娠绒毛滋养细胞的调控机制研究提供可靠地研究载体。
二、材料与方法
(一)标本采集
1.标本来源
所有绒毛标本均来源于2012.11在广州中医药大学第一附属医院妇科门诊就诊、宫内正常妊娠6-8周且自愿要求终止妊娠的妇女。患者对本研究知情同意。
2.取材方法
无菌采集绒毛组织,置于含有双抗的PBS液中充分洗涤3次,仔细去除蜕膜及血污,至肉眼观察冲洗液颜色清亮,将绒毛挑起装入无菌预冷PBS液中,快速送至实验室;用眼科剪和镊子去除多余的蜕膜,适当修剪成4-5mm3组织块,准备接种。
(二)材料
1.实验试剂
青霉素-链霉素(双抗)、PBS购自吉诺生物医药有限公司;
其他:石蜡、二甲苯、酒精、伊红、苏木素、中性树胶。
2.实验动物
(1)动物来源:健康雌性未孕BALB/c-nu裸鼠45只,SPF级,体重14.7-19.3g,周龄5-6周。由广东省医学实验动物中心提供,动物合格证号4407208587。
(2)识别方法:采用鼠耳缘打孔标记法对裸鼠进行编号,以鼠耳孔号和笼具双重编号标记识别。
(3)饲养管理:动物饲养在广东省医学实验动物中心SPF级动物房,实验动物使用许可证号:SYXK(粤)2008-0002。动物饲养条件:6只/箱,群养,饲养温度与湿度:20-26℃,40-70%,采用10h∶14h昼夜间断照明,饲养室条件始终保持稳定,以保证试验结果的可靠性。喂以鼠专用全价颗粒饲料(由广东省医学实验动物中心提供)。自由进食饮水,饮用水为广东省医学实验动物中心提供的纯净水,由饮水瓶自由摄取。
(4)检疫:对购入裸鼠检疫4d。期间每日检查动物一次,若发现不健康的裸鼠立即剔除,选用健康裸鼠均进行实验。
3.主要仪器
RM2135型轮转切片机,德国LEICA公司;
TS-12C型生物组织全自动脱水机,湖北孝感医用仪器有限公司;
BM-VII型生物组织包埋机及冷冻机,湖北孝感医用仪器有限公司;
CS-VI型摊片烤片机,湖北孝感医用仪器有限公司;
RS-18型生物组织全自动染色机,湖北孝感医用仪器有限公司;
BX41型病理图像分析系统,日本奥林巴斯公司;
BS-3000A系列电子天平,精度:0.1g,上海友声衡器有限公司;
注射器、手术器械(刀、弯钳、无齿镊等)。
(三)造模方法
  按30mg/kg腹腔注射戊巴比妥钠麻醉裸鼠,将其仰卧固定于操作板上,腹部75%酒精消毒,自腹中线脐下方做一长约1-1.5cm的切口,进入腹腔,将处理好的两块人妊娠绒毛组织碎块分别贴于裸鼠两侧盆腔表面,依层关腹,缝合切口,密切观察动物的状态。
(四)技术路线(图1)

三、指标观察
(一)一般情况:观察动物被毛、行为活动、精神状态等,每天观察记录1次;每周测量体重、摄食量和饮水量2次。
(二)种植包块观察:于造模第7d,麻醉后解剖裸鼠移植模型,观察种植部位有无包块形成,见包块形成为造模成功。
(三)病理学检测:将造模成功的BALB/c-nu裸鼠按照体重随机分为3组,中药组、西药对照组、阴性对照组,并每组随机宰杀1只裸鼠,取种植部位组织,进行病理学检查,确定种植包块滋养细胞存活。
(1)制片:组织标本经取材、固定、修块、流水冲洗、脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋后,石蜡切片,HE染色、封片;
(2)镜检:显微镜下观察裸鼠皮下移植人宫内妊娠绒毛组织结构及细胞形态变化,并用OLYMPUS BX41显微镜拍照。
四、结果
(一)裸鼠一般生长情况:精神状态良好、活动力、反应力未见异常,无恶心呕吐、腹泻等症状、无死亡。
(二)种植包块观察:麻醉后解剖裸鼠移植模型,在45只裸鼠中,有39只在种植部位见包块形成,成模率为86.67%。(图2)

(三)病理学检测:送检裸鼠体内移植组织块3例。镜下均见组织边缘绒毛滋养细胞细胞核清晰。(图3、4、5)

五、讨论
(一)裸鼠体内移植模型是良好的实验载体
  由于动物发生的异位妊娠多为腹腔妊娠,与灵长类动物异位妊娠的治疗、预后均不相同,目前报道的灵长类动物异位妊娠仅有3例[69、70]。因此,异位妊娠动物模型的研究一直以人源标本、体外模型为主。近年来,啮齿目动物模型的研究有较多的进展,多围绕输卵管形态与功能的改变展开。
  然而,组织在体内的微环境及代谢特点与体外培养的细胞仍存在差异,以上实验模型尚不能模拟异位妊娠的关键病理状态,对于临床药物的深入研究难以提供可靠的研究载体。因此,更接近于人的生理、病理状态的动物模型,能获得与人体内相似的微环境,从而表现更为类似的生物学特性。本研究采用人源绒毛组织块移植法建立的异位妊娠裸鼠体内移植模型,模拟了异位妊娠的关键病理环节,为异位妊娠的发病机制、药物作用机制等进一步研究提供了良好的实验载体。
(二)造模方法的探讨
  在动物模型研究中,裸鼠被誉为活的试管,这是因为其先天无毛、无胸腺,T淋巴细胞功能缺乏,对异种移植物不产生排斥反应,异种移植后的人体肿瘤在裸鼠体内仍保持其原有的组织形态、免疫学特点、特有的染色体组型以及对抗癌药和电离辐射等原有特性。那么,能否利用裸鼠对异种移植物不排斥、滋养细胞或绒毛组织块的浸润行为来建立异位妊娠裸鼠移植模型值得探讨。
  异位妊娠病因复杂,然而,滋养细胞及其侵袭微环境可能是发病的关键环节。在导师课题组的前期研究中,已经对体外培养的人源输卵管妊娠绒毛滋养细胞进行了系统研究,那么,能否将体外培养的人源输卵管妊娠绒毛滋养细胞移植裸鼠体内,从而将异位妊娠发生的“种子”和“土壤”这一病理关键问题稳定地反映在体内动物模型中呢?因此,本实验在模型建立的探索过程中,除了采用组织块移植法造模外,亦采用了滋养细胞注射法建立异位妊娠裸鼠模型。选择用胰酶消化后,收集培养的第4-5代滋养细胞,以1×107 个/ml的人宫内滋养细胞和输卵管妊娠滋养细胞分别注射在裸鼠皮下、腹壁和宫角。造模后7、15天分别观察包块情况,并行病理学检测。
  实验结果显示,细胞注射法在建立异位妊娠的裸鼠移植模型时,成瘤失败率高,且造模后7、15天行免疫组化检测,结果显示滋养细胞死亡,说明此法造模不能形成有持续活性的滋养细胞。这可能与滋养细胞特性有关。虽然滋养细胞有一定类似肿瘤细胞的侵袭性,但其毕竟不同于肿瘤细胞,难以形成新生血管以营养瘤体。另外,绒毛组织块种植法其种植部位在腹盆腔,具有类似于人体异位妊娠的微环境,腹膜强大的吸收能力及腹盆腔内丰富的血管,为绒毛组织块的粘附、种植提供了良好的条件,而注射法种植部位为皮下和肌层组织,有异于人类异位妊娠时绒毛滋养细胞的微环境,这可能也是细胞注射法失败的原因之一。(图6、7、8)

  因此,裸鼠组织块移植法成功率高,种植后免疫组化显示滋养细胞存活,实验方法简便易行,既便于提高实验效率,也可为进行药物筛选及药效观察提供充足时间,是建立异位妊娠动物模型较为理想的方法选择。
第二节 化瘀消癥杀胚中药对裸鼠体内移植模型的影响
一、化瘀消癥杀胚中药对裸鼠体内移植模型滋养细胞形态的影响
(一)研究目的与内容
用化瘀消癥杀胚中药干预裸鼠移植模型,并设立西药组(甲氨蝶呤肌注)及阴性组(纯净水灌胃)作为对照组,观察化瘀消癥杀胚中药对裸鼠移植模型一般情况、包块的影响,并采用光镜、免疫组化观察干预后的绒毛滋养细胞的组织结构的影响。
(二)材料与方法
1.材料
(1)实验试剂
PBS购自吉诺生物医药有限公司;
鼠抗人CK18抗体、兔抗鼠Bcl-2抗体、Bax抗体、18SA1021小鼠IgG免疫组化试剂盒、SA1022 兔IgG免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒、0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)均购自博士德生物技术有限公司;
小鼠绒毛膜促性腺激素(CG) ELISA试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司;
其他:3%H2O2水溶液(现配现用)、二甲苯、酒精、苏木素、伊红、中性树胶、注射戊巴比妥钠。
(2)实验用药物
①中药饮片均购自广州中医药大学第一附属医院药房,药材鉴定由广州中医药大学药学院李耿讲师协助并出具鉴定证明。(产地、批号见表1)

(3)主要仪器
BX41型显微镜,日本奥林巴斯公司;
SW-CJ-2FD型超净工作台,苏州净化有限公司;
RM2135型轮转切片机,德国LEICA公司;
TS-12N型生物组织全自动脱水机,湖北孝感医用仪器有限公司;
BM-VII型生物组织包埋机及冷冻机,湖北孝感医用仪器有限公司;
CS-VI型摊片烤片机,湖北孝感医用仪器有限公司;
RS-18型生物组织全自动染色机,湖北孝感医用仪器有限公司;
CU420型电热恒温水箱,上海一恒科技有限公司;
HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统,武汉千屏影像技术有限责任公司;
TS-8型转移脱色摇床,江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司;
BS-3000A系列电子天平,精度:0.1g,上海友声衡器有限公司;
微量有机分析专用超纯水机,颐洋企业发展有限公司;
移液枪、微波炉、中药罐、注射器、灌胃器、试管、毛细玻管、标本瓶、手术器械(刀、弯钳、无齿镊等)。
2.方法
(1)药物制备
①中药复方制备:将丹参150g、赤芍150g、桃仁150g、天花粉150g、紫草150g,以上药材蒸馏水浸泡30min,每次加8倍量的水,煮40分钟,煎两次,将两次滤液合并,浓缩为500mL、生药含量为1.5g/mL的药液,-20℃保存备用。使用前平衡至室温。
②甲氨蝶呤药液配制方法:准确称取3.6mg的甲氨蝶呤,用注射用水定容至2mL,得1.8mg/mL的药液。
(2)分组
将造模成功的BALB/c-nu裸鼠按照体重随机分为3组,中药组、西药对照组、阴性对照组,12只/组。
(3)给药方法
①中药组:裸鼠等效剂量是人的单位体重剂量的9.01倍[78],按人一日服用生药1.25g/kg剂量计算出裸鼠每天剂量为11.25g/kg,即按0.075mL/10g体重给予1.5g/mL化瘀消癥杀胚中药灌胃。每天1次,连续给药观察7d,动物禁食12h后,采血,处死动物。
②西药对照组:按人用药量1mg/kg剂量计算出裸鼠给药剂量为9mg/kg,即第1d按0.05mL/10g体重单次肌肉注射1.8mg/mL甲氨蝶呤(小鼠一侧注射量不超过0.1mL),继续正常喂养,连续观察7d,动物禁食12h后,采血,处死动物。
③阴性对照组:小裸鼠每天按0.075mL/10g体重灌胃给予纯净水,每天1次,连续观察7d,动物禁食12h后,采血,处死动物。
3.技术路线(图9)

(三)指标检测
1.一般情况:观察动物被毛、行为活动、精神状态等,每天观察记录1次;每周测量体重、摄食量和饮水量2次。
2.小鼠绒毛膜促性腺激素(CG)的ELISA检测:于第1天给药前、处死动物前,各组动物分别采血0.2mL,取血清,-80℃保存,进行小鼠绒毛膜促性腺激素(CG)的ELISA检测。
(1)将各种试剂移至室温(18-25℃)平衡至少30min,配制洗液工作液(按1:20倍用去离子水进行稀释)和样本稀释工作液(按1:10倍用生理盐水进行稀释)。
(2)将酶标板取出,设一个空白对照孔、不加任何液体;每个标准点依次各设两孔,每孔加入相应标准品50μL;其余每个检测孔直接加待测样本50μL。
(3)每孔加入酶结合物50μL(空白对照孔除外),再按同样的顺序加入抗体50μL,充分混匀,贴上不干胶封片,置37℃温育1h。
(4)手工洗板,弃去孔内液体。洗涤液注满各孔,静置10s甩干,重复三次后拍干。
(5)每孔加入显色A液50μL,显色剂B液50μL,振荡混匀后,37℃避光显色15min,每孔加入终止液50μL。
(6)用酶标仪在450nm波长依序测量各孔的光密度值(OD值)。在终止反应10min内进行检测,通过计算机拟合浓度—吸光度值曲线,反算出待测样本中CG的含量。
3.包块固定:动物处死后,解剖动物,找出包块,拍照;完整剥离包块,分组排列照相;每组随机挑取6只动物的包块用4%多聚甲醛固定,剩下6只动物包块于-80℃中保存。
4.光镜检测:石蜡包埋,切片,HE染色,进行病理学检查。
5.免疫组化检测:利用免疫组化技术检测对滋养细胞CK18的表达。
(1)制片:组织标本经取材、固定、修块、流水冲洗、脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋后,石蜡切片。
(2)脱蜡和水化:组织切片置于二甲苯中浸泡10min,更换二甲苯后再浸泡10分钟;无水乙醇中浸泡5min;95%乙醇中浸泡5min;90%乙醇中浸泡5分钟;80%乙醇中浸泡5min;70%乙醇中浸泡5min;蒸馏水中浸泡5min。
(3)用3%H2O2,室温封闭10min,蒸馏水洗三次各5min。
(4)抗原微波热修复:将组织切片放入0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0),在微波炉里加热5min至沸腾后,断电,冷却到室温,反复2次。PBS洗2次每次5min。
(5)滴加5%BSA封闭液,室温30min,甩去多余液体。
(6)滴加Ⅰ抗(200倍稀释的CK-18抗体、100倍稀释的BCL-2或BAX抗体),4℃过夜,PBS洗3次每次5 min。
(7)滴加生物素化二抗, 37℃30min,PBS洗3次每次5 min。
(8)滴加链霉素化亲和素试剂,37℃30 min,PBS洗4次每次5 min。
(9)DAB显色:DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色(镜下掌握显色程度)。
(10)蒸馏水洗。苏木素复染1 min、饱和磷酸氢二钠分化。
(11)脱水、透明、封片、镜检。
6.实时定量PCR检测:利用qRT-PCR技术采用检测雌激素受体(ER) 、孕激素受体(PR)和基质金属蛋白酶(MMPs)。
7.Western-blot检测:利用Western-blot技术检测滋养细胞凋亡相关基因Bax和Bcl-2的表达。
(四)统计方法
使用SPSS17.0统计分析软件进行处理,计量资料先进行正态性和方差齐性检验,满足要求则采用单因素方差分析,未满足要求用秩和检验,计数资料采用χ2检验。数据以均数加减标准差表示( )。
(五)结果
1.裸鼠一般生长情况:精神状态良好、活动力、反应力未见异常,无恶心呕吐、腹泻等症状、无死亡。
2.体重情况(表2)

6.形态学检测
阴性组:送检裸鼠体内移植人宫内妊娠绒毛组织6例。镜下见位于中间部位的绒毛组织坏死。(图10)
西药组:送检裸鼠体内移植人宫内妊娠绒毛组织6例。镜下所见基本同阴性对照组。(图11)
中药组:送检裸鼠体内移植人宫内妊娠绒毛组织6例。镜下所见基本同阴性对照组。(图12)


7.免疫组化检测
(1)本实验免疫组化结果显示CK18 蛋白,CK18 蛋白表达部位主要位于细胞质内,表达的细胞类型分别为位于绒毛边缘的梭形细胞和位于绒毛与绒毛之间的间质细胞。而绒毛内的梭形细胞均未见阳性表达。(图13-15)

(2)在阴性对照组,阴性表达2例,+阳性表达3例,强阳性表达+++1例,而在西药对照组,阴性表达4例,+表达2例;在中药对照组中均为阳性表达,表达级别从+~+++,分别为2、3、1例。(表6,阴性组标本以Y表示,西药组以X表示,中药组以Z表示)

(3)各组绒毛组织内CK18阳性表达的比较。(表7)

二、化瘀消癥杀胚中药对裸鼠体内移植模型ER、PR、MMPs的影响
(一)研究目的与内容
采用时荧光定量PCR检测(quantificational RT-PCR)技术检测药物干预后裸鼠移植模型ER、PR、MMP2的表达,了解化瘀消癥杀胚中药对异位妊娠着床相关调控因子的影响,拟从分子水平探讨化瘀消癥杀胚中药对异位妊娠的可能调控机制。
(二)实验材料
定量PCR用的SYBR Green qPCR SuperMix购自Invitrogen公司
定量PCR仪:ABI PRISM? 7500 Sequence Detection System
(三)方法
1.总RNA抽提
(1)用液氮研磨组织至粉末,加入1ml Trizol (Invitrogen)溶液,吹打混匀,使组织充分裂解,静置5min;
(2)加入200μl氯仿,剧烈振荡混匀30s,使水相和有机相充分接触,室温静置2min;
(3)4℃下,14,000g离心15min,可见分为三层,RNA在上层水相,移至另一个新的RNase  free EP管;
(4)沉淀RNA:加入等体积的异丙醇,轻柔地充分混匀,室温静置10min;
(5) 4℃下,14,000g离心10min,收集RNA沉淀,去上清;
(6)用75%乙醇洗涤两次,超净台风干;
(7)加入15~60μl DEPC水溶解沉淀。
2.总RNA纯度和完整性检测  
(1)纯度检测:取1μl RNA样品50倍稀释,在BioPhotometer plus 艾本德核酸蛋白测定仪上测定OD值,OD260/OD280的比值大于1.8,说明制备的RNA较纯,无蛋白质污染。
(2)总RNA完整性检测:取RNA样品1μl,1%琼脂糖凝胶电泳80V×20min,用凝胶成像系统观察总RNA的5s rRNA, 18s rRNA和28s rRNA条带,三条条带完整的话即可证明总RNA抽提比较完整。
3.逆转录
(1)在RNase free的PCR管中配置下列溶液

(2)将上述溶液吹打均匀,置85℃保温5min,使RNA变性。随后立即冰上致冷,以防止RNA复性。
①在该PCR管中加入下列试剂(Promega)

②将上述20μl反应溶液30℃保温10min;
1) 42℃保温60min;
2)85℃保温10mn。
4.定量PCR
(1)检测序列片段大小
内参片段: 18srRNA-112bp
目的片段: ER-152bp ;PR-160bp;MMP2-462bp
(2)设计的引物

(4)反应条件          
50℃ 2min;95℃ 2min;95℃ 15s,60℃ 32s读板,40 cycles;     
融解曲线分析:温度60℃-95℃。
每个样重复3次
(四)结果
1.ER的表达:每组6个样品,共18个样品(图16)

  三组间ER相对表达量经单因素方差分析,差异有统计学意义(P<0.05);经LSD组间两两比较,中药组、西药组与阴性组比较,表达量均降低,差异均有统计学意义(P<0.05);中药组与西药组比较差异无统计学意义(P>0.05)。三组间PR相对表达量经秩和检验,差异有统计学意义(P<0.05);对PR相对表达量做秩变换后,经LSD组间两两比较,中药组、西药组与阴性组比较,表达量均降低,差异均有统计学意义(P<0.05);中药组与西药组比较差异无统计学意义(P>0.05)。三组间MMP2的相对表达量经单因素方差分析,差异无统计学意义(P>0.05)。

三、化瘀消癥杀胚中药对裸鼠体内移植模型滋养细胞凋亡相关基因的影响
(一)研究目的与内容
采用Western-blot技术检测药物干预后裸鼠移植模型滋养细胞凋亡相关基因Bax和Bcl-2的表达,了解化瘀消癥杀胚中药对滋养细胞凋亡相关基因的影响,拟从基因水平系统探讨化瘀消癥杀胚中药对异位妊娠的可能调控机制。
(二)实验材料
HRP标记的GAPDH优质内参,稀释倍数:1:10,000,生产商上海康成生物;
BAX一抗、BCL2一抗,稀释倍数:1:1000;
Rabbit anty- Mouse IgG二抗,稀释倍数:1:1000;Goat  anty- Rabbit IgG二抗,稀释倍数:1:20000,生产商southern biotech;
医用X射线胶片,型号XBT-1,规格12.7×17.8cm,生产商柯达;
发光液IMMOBILON WESTERN CHEMILUM HRP SUBSTRATE,生产商MILLIPORE;
PVDF膜 Immobilon-P Transfer Membrane,型号0.45 μm,生产商MILLIPORE;
酶标仪,赛默飞世尔(上海)仪器有限公司;
垂直电泳槽、转移电泳槽,上海天能科技有限公司;
电泳仪,北京百晶生物技术有限公司;
高速离心机,珠江黑马公司;
超声仪细胞破碎仪,宁波新芝生物科技股份有限公司。
(三)实验方法
1.总蛋白抽提
(1)将100mg组织块置于匀浆器中球状部位,用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。
(2)加500μl RIPA裂解液裂(含PMSF和Cocktail)于匀浆器中,进行匀浆此过程一直在冰上操作。要重复碾几次使组织尽量碾碎。
(3)用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中,冰上裂解30 min,然后在4℃下14000rpm离10min,取上清分装于1.5ml离心管中并置于-80℃保存。
(4)取部分上清,加入上样buffer,煮沸10 min。缓慢恢复室温后,稍离心,放于-20℃保存。
2.稀释实验样品
(1)每个样品取2ul,加38ul H2O稀释20倍。按顺序排列好。
(2)配制BCA试剂浓度测定工作液:取50体积A液,加入1体积B液,充分混匀。(现配现用)
(3)准备96孔板,各取20ul稀释好的标准样品和实验样品于96孔板中。每孔加入200ul工作液,37℃避光孵育30min。
(4)于酶标仪中读取吸光值,波长为560nm左右。
3.SDS-PAGE电泳
(1)准备蛋白上样缓冲液:将提取好样品的蛋白溶液和5×上样缓冲液按5:1混合,煮沸5min。
(2)凝胶电泳前,每孔均用1×电泳缓冲液清洗。上、下层电泳槽中加入1×电泳缓冲液,上层槽中缓冲液液面需超过上样孔顶端。
(3)电泳:80V恒压50分钟,120V恒压电泳至溴酚蓝刚出胶底部止。
4.蛋白质转移
(1)PVDF膜甲醇预处理3-5秒,放至转印液浸润半小时。
(2)取出凝胶,将其放至滤纸上,形成凝胶转印堆积层,滤纸,凝胶,PVDF膜,滤纸,凝胶转印堆积层这样的“三明治”结构。此操作必须将气泡完全去除。
(3)按正负极方向放置转印夹。
(4)低温条件下,100V恒压60-120分钟。
5.免疫印记
(1)取出杂交膜,TBST漂洗5分钟,三次。
(2)5%脱脂奶粉溶液室温封闭1小时或4℃过夜。
(3)TBST洗膜5 min,三次。
(4)合适的一抗稀释浓度4℃过夜或37℃孵育2h。
(5)TBST洗膜5 min,三次。
(6)相应二抗稀释液37℃孵育1h。
(7)TBST洗膜5 min,三次。
(8)蒸馏水漂洗膜2 min,弃去液体。共洗三次。
(9)将杂交膜置于一透明塑料板上,注意不要让膜干燥。用一干净移液器将化学荧光发光底物均匀地加到膜的表面,并使反应持续5 min。
(10)用试剂盒提供的滤纸吸去膜表面多余的底物溶液,放至暗盒。显影。
(四)结果
1. 阴性组的Bax和Bcl-2的表达情况(图20)

2. 西药组的Bax和Bcl-2的表达情况(图21)

3. 中药组的Bax和Bcl-2的表达情况(图22)

4.各组动物Bcl-2的灰度值和Bax灰度值比较。(表9)

四、讨论
  由于缺乏体内移植动物模型,异位妊娠的实验研究对象比较局限,大部分需要依赖体外模型,而体外模型难以呈现异位妊娠的病理状态。本实验发现绒毛组织块移植法在建立异位妊娠裸鼠体内模型方面具有成模率高、操作方便、种植后滋养细胞活性持续时间长等优势。
以体内移植模型为研究载体,用化瘀消癥杀胚中药干预,并设立甲氨蝶呤组和阴性组对照,观察干预后绒毛滋养细胞的组织结构的变化,雌孕激素受体、基质金属蛋白酶及细胞凋亡相关基因的表达。
(一) 裸鼠一般生长情况
36只裸鼠在观察过程中精神状态良好、活动力、反应力未见异常,无恶心呕吐、腹泻等症状。摄食量、饮水量、体重未见明显差异。实验结束后裸鼠无死亡。说明组织块移植法造模后裸鼠存活率高,干预药物剂量设置合理,未引起裸鼠死亡。
(二)包块大小情况
由于各组给药前为在体测量包块大小,数据相对粗略,实验结束后,解剖动物,取出包块,进行重量和体积测定,数据相对精确。所以,给药后包块体积较给药前包块体积明显缩小,可能由于测量方法不统一引起,不能说明药物干预或绒毛组织在裸鼠体内自行消融所致。根据临床观察,异位妊娠药物保守治疗时,包块缩小、消失的时间相对较长,而动物实验给药7天,对包块变化影响不大,因此,给药后包块体积、重量各组间未见统计学差异。
(三)小鼠绒毛膜促性腺激素(CG)的ELISA检测
通过ELISA检测,给药前后小鼠绒毛膜促性腺激素(CG)值都较低,组间比较无统计学差异。由于小鼠和人体的不同,目前尚没有小鼠妊娠绒毛膜促性腺激素的阳性标准。药物对动物体内绒毛膜促性腺激素的影响尚有待进一步的研究。
(四)光镜形态与免疫组化检测
经干预后,三组裸鼠体内移植的绒毛组织块标本在光镜下均见中间部位的绒毛组织坏死,三组光镜观察结果未见明显差异。免疫组化结果显示,三组标本的CK表达的细胞类型,分别为位于绒毛边缘的梭形细胞和位于绒毛与绒毛之间的间质细胞,而绒毛内的梭形细胞均未见阳性表达,亦说明中间部分绒毛组织坏死。本实验干预时间较短,对组织形态学的改变不大,故三组间组织形态学差异无统计学意义。
(五)ER、PR、MMPs的表达情况
雌、孕激素受体是与胚胎着床相关的重要调控因子,较多有关人源标本的研究显示,输卵管妊娠妇女的输卵管中缺乏ERα蛋白、PR蛋白表达,而行子宫切除术和正常月经周期妇女的输卵管中能够正常表达。本实验采用qRT-PCR技术,分别检测了中药组、西药组和阴性组的ER、PR的表达量,结果发现与阴性组比较,中药组和西药组的表达量均明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05),而西药组与中药组的ER、PR相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。说明,化瘀消癥杀胚中药能够从受体水平拮抗雌孕激素,从而导致绒毛组织因缺乏雌孕激素而变性、坏死。这可能是其对异位妊娠作用的调控机制之一。
基质金属蛋白酶(MMPs)是一种几乎能降解ECM中各种蛋白成分的酶,有助于侵袭转移。输卵管妊娠时,较高水平的MMP2促进输卵管黏膜ECM降解,有利于绒毛滋养层细胞穿透母体输卵管黏膜。本实验采用qRT-PCR技术,分别检测了中药组、西药组和阴性组的MMP2的表达量,结果发现三组的MMP2相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。然而,通过均值比较可以发现,中药组的MMP2表达量最低,其次是西药组。这可能与本实验样本量较少有关,加大样本量可能更能够观察到杀胚药对裸鼠体内模型MMPs的影响。由此推测,化瘀消癥杀胚中药引起MMP2下降,导致输卵管黏膜ECM降解的减少,使得绒毛滋养细胞浸润深度减弱,干扰着床,最终导致绒毛变性、坏死。
(六)细胞凋亡相关调控基因Bax/Bcl-2的表达情况
Bcl-2是抗凋亡的代表基因,Bax是促凋亡蛋白的代表者。在输卵管妊娠时,Bcl-2表达量升高,细胞凋亡诱导失败,可能会导致滋养细胞不受控制的入侵和渗透的输卵管壁。本实验采用western-blot技术,检测三组动物Bcl-2和Bax的灰度值。结果发现,各组动物Bcl-2和Bax灰度值比较差异均无统计学意义(P>0.05);但是,中药组的Bax灰度值均数较西药组和中药组明显升高,说明化瘀消癥杀胚中药有明显上调Bax的趋势,能够促进滋养细胞凋亡,导致滋养细胞入侵和渗透的输卵管壁的作用减弱,最终绒毛变性、坏死,从而起到杀胚的作用。三组间差异无统计学意义可能与样本数较少有关,中药组中有2例Bax灰度值低于1000,引起标准差过大,导致组间差异无统计学意义,在今后的研究中,可以通过加大样本量来控制对结果的影响。另外,检测细胞凋亡相关调控基因的表达时,组织块的量对结果影响大,在今后的裸鼠组织块移植时,可以采用组织块称重的方法,选取同等重量的组织块进行种植,减少对蛋白测量的影响。

第三章  临床部分
一、研究内容和目的
  对2010年5月至2012年2月收集的输卵管妊娠病例,进行辨病分期、辨证分型和计算病情影响因子总积分后,确定可以进行“中西医结合”药物保守治疗的病例,按无盲法、不等随机对照试验,将病例分为观察组和对照组。观察组按照“输卵管妊娠中西医结合治疗方案”中的中西医结合方法治疗,对照组用纯西医治疗。
通过临床资料的搜集、对比和统计分析,对“输卵管妊娠中西医结合治疗方案”的有效性、科学性和可行性作出评价,深化异位妊娠的系列研究。
二、研究对象
(一)病例来源
2010年5月至2012年2月于广州中医药大学第一附属医院或协作单位江西省新余市中医院、浙江省温州市中医院妇科住院,符合“中西医结合”药物保守治疗的输卵管妊娠患者共70例。
(二)病例选择
1.异位妊娠的诊断标准(辨病标准)
(1)有停经史(个别无明显停经史),下腹疼痛(小部分可无下腹疼痛),或有不规则阴道流血。
(2)妇科检查:子宫常大或略大,一侧附件或可触及包块,有压痛。
(3)β-HCG阳性。
(4)盆腔B超:宫内未见孕囊,宫旁出现液性或混合性回声区,或该区有胚芽或原始心管搏动;或宫旁回声区无输卵管妊娠声像特征,但腹腔内存在无回声暗区或直肠子宫陷凹处有积液。
(5)不伴有腹腔移动性浊音或休克。
(6)诊断性刮宫及病检未见绒毛。
2.研究对象的纳入标准
根据“输卵管妊娠辨病分期和辨证分型标准”对诊断的异位妊娠患者进行辨病分期和辨证分型,并根据“输卵管妊娠病情影响因子积分法”进行评分,选择适合中西医结合治疗的病例,分为两大组作为研究对象进行临床观察。
(1)输卵管妊娠辨病分期和辨证分型标准(该标准已通过广东省科技成果鉴定):
1)辨病分期:主要是根据输卵管妊娠是否已发生破裂、流产分为未破损期和已破损期。辨病分期的要点:
<1>符合以下情况者列为未破损期(输卵管妊娠未发生破裂或流产):
① 多有停经史,无明显下腹疼痛,或伴有阴道不规则流血。
② 妇科检查,子宫略大,一侧附件区或可触及包块。
③ β-HCG阳性或阴性。
④ 盆腔B超:宫内未见孕囊,宫旁出现轮廓不清的液性或混合性回声区,或该区有胚芽或原始心管搏动。
<2>符合以下情况者列为已破损期(输卵管妊娠已发生破裂或流产):
① 多有停经史,曾突发一侧下腹剧烈疼痛,或有反复明显的下腹疼痛,可伴有阴道不规则流血,或伴有晕厥或休克。
② 妇科检查:阴道后穹隆或饱满,子宫颈有举摆痛,子宫或有漂浮感,一侧附件区可触及到边界不清的包块,压痛明显。
③ β-HCG阳性或阴性。
④阴道后穹隆穿刺或腹腔穿刺,或可抽到不凝血。
⑤ 盆腔B超:宫内未见孕囊,盆腔内存在无回声暗区或边界欠清的混合性包块或子宫直肠窝有积液。
2)辨证分型:
<1>未破损期:辨证分为两型
①胎元阻络型:或有不规则阴道流血或下腹隐痛,β-HCG阳性,或经B超证实为输卵管妊娠,但未发生输卵管妊娠破裂或流产。舌暗苔薄,脉弦滑。
②胎瘀阻滞型:胎元(包括胚胎和滋养细胞活性)已死亡,但未发生输卵管破裂或流产,腹痛减轻或消失,可有小腹坠胀不适,B超证实输卵管有局限性包块。β-HCG曾经阳性,现转为阴性。舌质暗,脉弦细或涩。
<2>已破损期:辨证分为三型
①气血亏脱型:多有停经,或不规则阴道流血,突发下腹剧痛,面色苍白,冷汗淋漓,四肢厥冷,烦躁不安,甚或昏厥,血压明显下降,β-HCG阳性,后穹隆穿刺、或腹腔穿刺、或B超提示有腹腔内出血。舌淡苔白,脉细微。
②正虚血瘀型:输卵管妊娠发生破裂或流产不久,腹痛拒按,或有不规则阴道流血,头晕神疲。妇检或B超检查盆腔一侧有混合性包块。β-HCG阳性。舌质暗,脉细弦。
③瘀结成癥型:输卵管发生破裂或流产已久,腹痛减轻或消失,小腹坠胀不适,妇检或B超检查盆腔一侧有局限的混合性包块。β-HCG曾经阳性,现转为阴性。舌质暗,脉弦细或涩。
2) 对研究病例按输卵管妊娠的病情影响因子评分模型进行评分(表10)。

3.排除标准
(1)不符合诊断标准和纳入标准者。                                                             
(2)严重心肝肾功能不全或有血液系统疾患者。
(3)输卵管妊娠合并宫内妊娠者。
(4)非输卵管性的异位妊娠。
(5)患者不同意,无法按方案进行治疗者。
(6)β-HCG阴性(滋养叶细胞已无活性)的输卵管妊娠患者。
(7)输卵管妊娠需手术治疗者。
4.终止和撤出临床试验的标准
(1)在试验期间出现严重毒副反应者。
(2)在试验期间出现其他疾病,影响试验进行者。
(3)在试验中不按要求治疗,自动退出者。
(三)随机分组方法
  考虑到患者在未破损期和已破损期两种类型上例数分布不平均,可能出现某期某型例数过少而无法统计的情况,故未按病情分期区分组别。因为大部分患者有中医药治疗要求,故采用不等的随机化对照。
  拟收集72例病例,从1到72编号,1-48为第一区段,为中西医组(观察组),49-72为第二区段,为西医组(对照组)。把写上编号、组别、治疗方法的卡片装入不透光信封备用,当合格的受试者进入研究时,随机拆封取卡,根据随机卡的分组情况实施治疗方案。(表12)(每个入组病例均填写病例报告表,见附录:附表2)。

三、研究方法
(一)研究设计方法
采用前瞻性、无盲法、不等随机对照研究。
(二)干预措施
1.中西医结合治疗:中医基础治疗+辨证分型治疗+西医治疗
(1)中医基础治疗:以活血化瘀,杀胚止痛为治法。
①宫外孕Ⅰ号方(丹参15g、赤芍15g、桃仁15g),每日1剂,再煎,日服两次。
②散结镇痛胶囊,4粒,口服,一日三次。(生产企业:江苏康缘药业股份有限公司,批文:国药准字Z20030127,规格:0.4g/粒,每盒30粒)
③外敷药:广州中医药大学第一附属医院予双柏散(侧柏叶、黄柏、大黄、薄荷、泽兰)100g,外敷下腹患侧,一日一次;协作医院予各自活血化瘀外敷药外敷下腹患侧,一日一次。

④丹参注射液,2Oml,静脉滴注,一日一次。(生产企业:正大青春宝药业有限公司,批文:国药准字Z33020177,规格:10ml/支,6支/盒)
(2)中医辨证分型治疗:
①胎元阻络型:在基础治疗上加强活血化瘀杀胚。可在宫外孕Ⅰ号方中选加蜈蚣(去头足)3条,紫草15g,天花粉20g,田七10g,或根据个体情况酌情加减。
②正虚血瘀型:在中医基础治疗上加强益气养血,化瘀杀胚。可在宫外孕Ⅰ号方中选加党参15g,黄芪20g,鸡血藤30g,田七10g,蜈蚣(去头足)3条,紫草15g,天花粉20g,或根据个体情况酌情加减。
(3)西医治疗选用米非司酮150mg口服,每日一次,连服5天。(生产企业:湖北葛店人福药业有限责任公司,批文:国药准字H20033551,规格:25mg/片,6片/盒)
2.西医治疗:即对照组
选用米非司酮150mg口服,每日一次,连服5天。
(三)疗程
治疗疗程以4周为上限。
(四)主要检测指标
(1)入院后,及时检查妇科B超、血β-HCG定量。
(2)观察治疗过程中:每周检查2次血β-HCG定量,每周检查1次妇科B超。
(3)入院后检查血常规及肝肾功能1次,治疗结束时复查血常规及肝肾功能1次。
(五)药物治疗的疗效标准
(1)近期治愈:阴道流血停止,腹痛消失;妇科B超检查妊娠包块缩小1/2以上;β-HCG测定连续两次阴性。
(2)有效:阴道流血停止,腹痛消失;妇科B超检查妊娠包块缩小不到1/2或无增大;β-HCG测定连续两次阴性。
(3)无效:腹痛加剧或伴失血性休克;妇科B超检查妊娠包块增大;β-HCG持续阳性且有增高趋势;中医治疗者需加用西药杀胚,或药物(中医或中西医结合)治疗者改行手术治疗。
(六)安全性指标
观察服药后病例新出现的症状和体征(如皮疹、发热、恶心、食欲不振、腹泻等)。入院后检查血常规及肝肾功能l次,治疗结束时复查血常规及肝肾功能1次。
(七)统计方法
用SPSS17.O统计软件。计量资料先进行正态性检验和方差齐性检验,满足要求两样本均数比较用t检验,未满足要求两样本均数比较用秩和检验;计数资料用χ2检验。
四、结果
(一)一般资料
1.病例入选与临床试验完成情况
根据诊断标准、纳入标准及排除标准,2010年5月至2012年2月共收集符合中西医结合药物保守治疗的输卵管妊娠患者72例。按不等的随机对照方法分为两组。观察组48例,对照组24例。其中,观察组2例在治疗过程中要求直接手术(2例病例血β-HCG均呈下降趋势)而退出试验。最后共70人完成试验,其中观察组46例,对照组24例。(编号1—3依次代表广州中医药大学第一附属医院、浙江省温州市中医院、江西省新余市中医院,病例分布情况见表13)

2.年龄情况
(1)所有入组病例年龄分布情况
70例病例中,25-29岁年龄段所占比例最高,占48.57%;其次是18-24岁年龄段,占24.29%;30-34岁年龄段占14.28%,大于35岁年龄段,占12.86%。 (表14,图24)

(2)两组年龄的比较(表15)

4.停经时间
(1)所有入组病例停经时间情况
70例病例中,停经天数为43-56天所占比例最高,占64.28%;其次是停经天数为21-42天,占22.86%;停经天数为57天以上者占12.86%。(表17,图25)

(2)两组停经时间的比较(表18)

6.B超下包块最大径
(1)所有入组病例B超下包块最大径情况
70例病例中,B超下包块最大径3-5cm者,占54.29%;包块最大径<3cm者,占40.00%;包块最大径>5cm者,占5.71%。(表20,图27)

7.B超下出血最大径
(1)所有入组病例B超下出血最大径情况
70例病例中,B超下出血最大径<3cm者,占75.71%;出血最大径3-6cm者,占22.86%;出血最大径>6cm者,占1.43%。(表22,图28)

8.初始血β-HCG值
(l)所有入组病例初始血β-HCG值情况
70例病例中,初始血β-HCG值在1000-3000IU/L之间者占67.14%;初始血β-HCG值大于3000IU/L者占31.43%;初始血β-HCG值小于1000IU/L者占1.43%。 (表23,图29)

(2)两组初始血β-HCG值的比较(表24)

(二)临床疗效研究结果
1.两组有效率的比较
70例病例中,观察组46例,有效率为89.13%;对照组24例,有效率为70.83%。(表26,图30)

2.腹痛消失时间的比较
70例病例中,观察组46例,有效且初始有腹痛症状者35例;对照组24例,有效且初始有腹痛症状者15例。(表27)

(三)安全性评价及不良反应
1.安全性评价
在治疗过程中,两组治疗前后血常规中的白细胞、血小板及肾功能均在正常范围变化;观察组有2例转氨酶轻度升高,停药后复查转氨酶恢复正常,对照组肝功能未见明显异常。
2.不良反应
观察组有1例中药外敷后出现外敷部位红疹,无水疱及渗液,不良反应发生率为2.17%, 停中药外敷后红疹消失,无其他不适。
五、讨论
  随着超声诊断、生化检测等技术的发展,异位妊娠的早期诊断率得到提高,为早期治疗提供有利条件。然而,由于缺乏系统指导,临床治疗过程中常常存在过度治疗或治疗不及等现象。邓高丕教授带领的课题组,经过近十年的临床研究观察,确立了新的输卵管妊娠的中医辨证分型体系,确定了相关病情影响因子,并制定了病情影响因子评分模型,按照不同的分期、证型和病情影响因子总积分,从而选择进行中医保守治疗、中西医保守治疗或手术治疗。此方案系统、有效地指导了临床实践工作,在前期的临床实践中,取得了较佳的诊疗效果。本研究在前期临床研究确定的“输卵管妊娠中西医结合治疗方案”的基础上,对输卵管妊娠病情影响因子、疗效进行分析,评价“输卵管妊娠中西医结合治疗方案”的有效性、科学性和可行性,进一步深化“输卵管妊娠”的系列研究。
(一)一般资料
1.年龄
本研究70例病例中,25-29岁年龄段所占比例最高,占48.57%;其次是18-24岁年龄段,占24.29%。
25-29岁是女性的最佳生育年龄,也是生理的性活跃期,然而随着性意识的开放,异位妊娠的发病率也逐年上升。性行为过早、多个性伴侣、性传播疾病增多、缺乏避孕知识、人流次数增多等因素容易引起生殖道炎症疾病,增加发生异位妊娠的风险。特别是18-24岁年龄段所占比重上升,提示异位妊娠的发生呈年轻化趋势。青少年本身性发育不成熟,自我保护意识差,对性认知偏差,缺乏正确性生活及避孕知识,相关的教育机构更应对他们加强性知识、性道德教育,加强避孕措施的宣传,促使他们培养健康生活态度,增强自我保护意识。
2.孕产次
在孕次方面,70例病例中,孕2、孕3次者居多,分别占31.43%、32.86%,首孕者占比例最少;在产次方面,产0、产1者居多,分别占50%、45.71%。结果显示,异位妊娠患者孕次数增多,但生育次数反之减少。
随着性观念的开放、无防范的婚前性行为,工作压力增大、生育观念的改变,导致未婚先孕者、多次人流者数量增加,房劳不节、多次人流,屡伤肾元,正气不足,湿热之邪易乘虚侵入,客于子宫、胞脉,与气血相博,气血运行不畅,正邪相争,日久不愈,而致少腹瘀滞,异位妊娠的发生率也随之上升。而异位妊娠可能导致重复异位妊娠和继发不孕,将直接导致不育,影响未来家庭幸福和社会稳定。因此,应加强正确的婚育观念的宣传,落实避孕措施,减少不必要的人流、引产,预防生殖道感染,以降低未育妇女异位妊娠发病率。
(二)输卵管妊娠病情影响因子
1.停经时间
本研究的70例病例中,停经时间为43-56天所占比例最高,占64.28%;其次是停经时间为30-42天,占22.86%。由此可以看出,大部分患者在8周之内被发现。近年来,超声诊断、生化检测等技术的发展,使异位妊娠的早期诊断率得到提高,对提高异位妊娠药物保守治疗的成功率做出了重要贡献。
输卵管管腔狭小,其肌层远不如子宫肌壁坚韧,亦无法形成完好的蜕膜,故不利于胚胎生长发育。胚胎在输卵管不同部位着床,随着停经时间的延长,其结局不同。壶腹部妊娠多在妊娠8-12周发展为输卵管妊娠流产,而峡部妊娠在6周左右就可能发生破裂,间质部因为周围肌层较厚、血运丰富,常在孕12-16周才发生破裂[26]。然而,无论哪个部位的输卵管妊娠,停经时间的长短在一定程度上预示着滋养细胞对输卵管的侵蚀程度,滋养细胞长时间侵蚀输卵管壁,导致输卵管血肿或周围血肿,直接影响输卵管功能恢复和盆腔微环境,不利于下次妊娠。
2.腹痛程度
本研究的70例病例中,症状表现为隐痛占70.00%;无痛者占25.71%;剧痛者仅3例,占4.29%。腹痛是患者的自觉症状,在输卵管妊娠发生流产或破裂之前,胚胎在输卵管内逐渐增大,常表现为一侧下腹隐痛或酸胀感。当发生输卵管妊娠流产或破裂时,血液流向腹、盆腔,表现为突发一侧下腹部撕裂样疼痛,大量腹腔内出血可致休克、危及生命。周力学等[79]通过观察30例休克型异位妊娠患者的早期临床表现,发现在破裂休克型异位妊娠,无不规则阴道流血、腹痛≤1d的短时腹痛的发生率,都明显高于其他类型的异位妊娠。本研究中观察对象为符合中西医结合药物保守治疗的患者,故有腹部剧痛症状的患者比例较少,且3例均为已破损期正虚血瘀型,症状表现与临床实际相符。
3.B超下包块最大径
本研究的70例病例中,B超下包块最大径3-5cm者,占54.29%;包块最大径<3cm者,占40.00%;包块最大径>5cm者,占5.71%。另外,所有无效的12例病例中,仅有1例治疗前包块最大径>5cm,余15例包块最大径均≤3cm,而在手术前的B超均较前明显增大。研究说明,单次妊娠包块的大小并不能预测治疗的成功与否,而包块的动态变化情况与成功与否密切相关。
4.B超下出血最大径
本研究的70例病例中,B超下出血最大径<3cm者,占75.71%;出血最大径3-6cm者,占22.86%;出血最大径>6cm者,占1.43%。B超监测出血量能协助估计患者内出血情况,对于评估治疗时机有较大的意义,避免了由于患者主观症状不明显而判断不及。本研究观察对象为符合中西医结合药物保守治疗的患者,故仅有1例出血最大径>6cm,符合临床实际。
5. 初始血β-HCG值
本研究的70例病例中,初始血β-HCG值在1000-3000IU/L之间者占67.14%;值大于3000IU/L者占31.43%;值小于1000IU/L者占1.43%。血β-HCG在诊断输卵管妊娠中是比较准确、敏感的客观指标,很多输卵管妊娠患者在未破裂前得到确诊,从而为非手术治疗创造了有利条件,在一定范围内血清β-HCG的高低可预示输卵管妊娠药物治疗的效果和疾病的转归,从而指导治疗方案的选择与调整,对保守治疗的效果评价具有重要意义。目前,对于保守治疗时血β-HCG的范围仍未有统一数值,对于是否需要设定保守治疗时β-HCG上限值、上限值为多少,有待进一步的研究。
(三)疗效评价
1.有效率的比较
本研究的70例病例中,观察组46例,有效率为89.13%;对照组24例,有效率为70.83%。两组有效率经比较差异有统计学意义(P<0.05)。并且在治疗过程中,观察组因患者要求手术而自动退出试验的2例病例中,血β-HCG值均呈下降趋势。说明,“输卵管妊娠中西医结合治疗方案”在进行病情评估时有效可行,通过化瘀消癥杀胚中药治疗异位妊娠疗效确切。
2.腹痛消失时间、阴道流血停止时间的比较
本研究的70例病例中,观察组46例,有效且初始有腹痛症状者35例;对照组24例,有效且初始有腹痛症状者15例。两组的腹痛消失时间经比较差异无统计学意义(P>0.05)。而观察组46例,有效且初始有阴道流血症状者40例;对照组24例,有效且初始有阴道流血症状者17例。两组的阴道流血停止时间经比较,差异无统计学意义(P>0.05)。
腹痛、阴道流血情况是异位妊娠发展过程中两种症状表现,也被作为治疗后协助判断疗效的因子。一般在病情稳定或病灶去除后腹痛、阴道流血方能消失。在本研究中,由于一部分患者在治疗前无腹痛、无阴道流血,因此治疗后其腹痛消失、阴道流血停止时间无法判断;另外,无效的病例因为最终进行了手术,其腹痛消失、阴道流血停止时间亦无法判断,所以最后计算腹痛消失、阴道流血停止时间的患者例数有限,对试验结果有一定影响。
3. 两组血β-HCG值下降至50%及10%时间比较
本研究中,观察组和对照组血β-HCG值下降至50%及10%时间经比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。而国内文献报道较多显示,中西医结合药物保守治疗在降低β-HCG方面优于单纯西药治疗。这可能与观察对象的β-HCG基线水平不同有关。本研究观察对象为符合中西医结合药物保守治疗的患者,要求患者的β-HCG值≥1000IU/L或包块>5cm,所有70例病例中,仅有1例β-HCG值<1000IU/L(包块>5cm),余69例β-HCG值≥1000IU/L。而其他研究中仅限定β-HCG的上限,而没有根据β-HCG不同水平区间划分。因此,本研究观察对象β-HCG的整体水平较高,β-HCG下降时间也相对延长,这可能是导致观察组和对照组β-HCG下降时间差异无统计学意义的原因之一。在今后的研究中,通过大样本的对照研究,结果会更客观。
4.治疗后包块变化的比较
本研究的70例病例中,观察组46例,有13例包块缩小≥1/2,27例包块缩小<1/2,6例包块增大;对照组24例,有2例包块缩小≥1/2,12例包块缩小<1/2,10例包块增大。两组包块缩小率经比较,差异有显著性统计学意义(P<0.01)。说明中西医结合治疗在盆腔包块缩小率方面优于单纯西药组。化瘀消癥杀胚中药具有抗凝、抗血栓等作用,能改善局部血液循环,影响妊娠输卵管粘膜细胞的生理代谢过程的正常进行,促进胚胎组织凋死亡,能减少胶原纤维合成,提高纤溶酶活性,使机化组织变软,利于血肿与妊娠物的吸收。
(四)不良反应分析
在治疗过程中,观察组有2例转氨酶轻度升高,停药后复查转氨酶恢复正常,无其他不适。一些杀胚的中药亦有小毒,如蜈蚣等,对肝肾功能有一定影响,与西药联合使用时,需要注意监测患者的肝肾功能,避免严重不良事件发生。另外,观察组有1例中药外敷后出现外敷部位红疹,无水疱及渗液,停中药外敷后红疹消失,无其他不适。与患者个人体质有关,对症处理后不影响疗效观察。
综上,通过临床验证,按照新的输卵管妊娠中医辨证分型体系及“输卵管妊娠中西医结合治疗方案”进行异位妊娠诊治,在指导临床病情的评估、治疗方案的选择上有较大优势,治疗成功率较高,特别是在促进盆腔包块缩小方面有较大优势,减少包块周围组织的粘连,有利于异位妊娠后输卵管功能的恢复。

结    语

  本研究针对异位妊娠缺乏动物体内移植模型的现状,采用人源绒毛组织块移植法建立了异位妊娠裸鼠体内移植模型,并用化瘀消癥杀胚中药进行模型干预,观察模型滋养细胞组织形态学、相关调控分子、基因等的变化情况。临床研究方面,在课题组前期临床研究确定的“输卵管妊娠中西医结合治疗方案”的基础上,运用前瞻性、无盲法、不等随机对照研究,对符合中西医结合药物保守治疗的病例进行输卵管妊娠病情影响因子、疗效分析,评价“输卵管妊娠中西医结合治疗方案”的有效性、科学性和可行性。
一、创新点
(一)建立了异位妊娠裸鼠体内移植模型
  首次成功建立了异位妊娠裸鼠体内移植模型,填补了异位妊娠缺乏有效体内移植模型的空白,为进一步的研究提供有效的研究载体,为今后系统深入探寻化瘀消癥杀胚的中药复方的作用机制和新药开发奠定了基础。
(二)实现中医理论创新
  少腹血瘀是异位妊娠的中医病机特点,本研究从分子基因水平阐述了化瘀消癥杀胚中药对异位妊娠影响的可能调控机制,发现化瘀消癥杀胚中药能够下调ER、PR,有上调Bax蛋白的表达的趋势,从而促进细胞凋亡,促进绒毛组织坏死。这为中医治疗早期异位妊娠提供了科学证据,深化、丰富了中医治疗异位妊娠的理论基础。
二、结论
(一)本研究运用人源绒毛组织块移植法成功地建立了异位妊娠裸鼠体内移植模型,具有成模率高、操作方便、种植后滋养细胞活性持续时间长等优势,填补了异位妊娠动物体内移植模型的空白,能为进一步的发病机制、药效物质基础等研究提供有效的研究载体。
(二)本研究采用qRT-PCR技术,发现化瘀消癥杀胚中药能够下调ER、PR表达,从而拮抗雌孕激素,引起绒毛组织变性、坏死。从分子水平阐述了化瘀消癥杀胚中药对异位妊娠影响的可能调控机制。
(三)本研究采用western-blot技术,发现化瘀消癥杀胚中药具有上调Bax蛋白的表达的趋势,从而促进细胞凋亡,促进绒毛组织坏死。从基因水平阐述了化瘀消癥杀胚中药对异位妊娠影响的可能调控机制。
(四)临床研究通过与纯西药组相比较,证实在符合中西医保守治疗的输卵管妊娠患者,依照“输卵管妊娠中西医结合治疗方案”进行治疗,疗效切实,治疗成功率较高,特别是中医药在促进盆腔包块缩小方面有较大优势,有利于输卵管功能的恢复。
三、不足与展望
(一)不足之处
1.裸鼠体内移植模型需要新鲜绒毛标本,在实际临床工作中,难以同一时间收集到足量异位妊娠绒毛标本用于建模,故本研究采用宫内妊娠绒毛标本造模。补充输卵管妊娠绒毛标本造模及模型的不断完善有待后期的进一步研究。
2.本研究重点在于建立裸鼠体内移植模型,而对于已建立模型的系统评价、评价指标的选择等等需要在今后的研究中不断完善。
3.由于研究时间有限,难以进行临床各期、各型的研究观察,有赖于进一步临床多中心循证医学研究。
(二)展望
1.在动物实验研究中,可以观察输卵管妊娠绒毛与宫内妊娠绒毛在建立异位妊娠裸鼠体内移植模型上的差异,不断完善异位妊娠裸鼠体内移植模型。
2.以异位妊娠裸鼠体内移植模型为载体,进一步研究化瘀消癥杀胚中药的药效物质基础,为今后的新药开发奠定基础。

 

参考文献 略

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