活血化瘀消癥杀胚中药对输卵管妊娠的作用机理研究

作者:孙佳琦|邓高丕
2015-4-22 阅读

中文摘要

目的:采用前瞻性的对照研究方法,探明活血化瘀,消癥杀胚的中药(宫外孕I号方加减)治疗输卵管妊娠未破损型的作用机理;通过采用电子显微镜,免疫组织化学染色的方法,检测使用中药药物治疗后手术(观察组)与直接手术(对照组)取得的妊娠输卵管粘膜上皮细胞的超微结构形态变化、绒毛组织Bcl-2的表达强度、输卵管粘膜雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)表达强度,期望探明活血化瘀、消癥杀胚中药对输卵管妊娠治疗的作用机理,这对丰富中医妇科理论,为指导临床辩证用药提供依据,并为治疗输卵管妊娠未破损期的中药治疗研制提供科学理论依据。
方法:
1、病例来源:2008.9-2010.2广州中医药大学第一附属医院妇科病房住院治疗经手术诊断为输卵管妊娠的病人。收集符合纳入标准的治疗组病人15例,对照组15例。
2、分组:
①观察组:宫外孕I号方(丹参15g、赤芍15g、桃仁15g)加天花粉20g、紫草15g、蜈蚣6g,每日一剂,两次水煎服。由广州中医药大学第一附属医院药剂科统一制备。采集中药治疗服药3-7天要求改为手术治疗的病人手术切除的妊娠输卵管。
②对照组:直接要求手术治疗患者手术切除的妊娠输卵管。
3、原位杂交法检测输卵管妊娠绒毛组织中Bcl-2表达。免疫组化SP法测妊娠输卵管粘膜ER、PR表达强度。
4、选取观察组、对照组各10例,收集手术时切除的输卵管组织进行电镜检测,观察两组输卵管粘膜细胞超微结构形态差异并评分比较。
5数据处理:按照数据分布状态采用两组独立样本的秩和检验及两组独立样本的t检验,用spss10.0统计软件进行分析。
结果:
1、观察组与对照组的输卵管妊娠绒毛Bcl-2表达水平比较,差异有统计学意义(P<0.05);
2、观察组与对照组的输卵管粘膜ER表达水平比较,差异没有统计学意义(P>0.05);
3、观察组与对照组的输卵管粘膜PR表达水平比较,差异有统计学意义(P<0.05),观察组pr表达水平较高;
4、观察组与对照组的妊娠输卵管黏膜细胞透射电镜超微结构有明显的差异。发现观察组的输卵管粘膜微绒毛稀少,内质网扩张,线粒体致密,线粒体内结构消失,核固缩。自拟评分表对其进行评分,并进行统计分析,两组评分差异具有显著性,观察组粘膜细胞损伤程度明显高于对照组。经Mann-Whitney U 检验(双侧),对照组、观察组输卵管粘膜上皮细胞电镜超微结构纤毛微绒毛组间差异P=0.000<0.05,差异有统计学意义,观察组输卵管粘膜上皮纤毛微绒毛较对照组稀少;线粒体改变组间差异P=0.001<0.05,差异有统计学意义,观察组输卵管粘膜上皮细胞内线粒体较对照组损伤严重;细胞核改变组间差异P=0.045<0.05,差异有统计学意义,观察组输卵管粘膜上皮细胞内细胞核较对照组损伤严重;内质网组间差异P=0.007<0.05,差异有统计学意义,观察组输卵管粘膜上皮细胞内线粒体较对照组损伤严重;胞内空泡组间差异P=0.143>0.05,没有统计学意义。
结论:
1 活血化瘀消癥杀胚中药可降低输卵管妊娠绒毛组织Bcl-2表达水平,从而阻碍了Bcl-2的抗细胞凋亡的作用,促进了输卵管妊娠胚胎组织死亡。
2 活血化瘀消癥杀胚中药可升高妊娠输卵管粘膜PR表达水平,从而降低输卵管粘膜对于胚胎组织的容受性,导致胚胎死亡。
3 活血化瘀消癥杀胚中药对妊娠输卵管粘膜ER表达水平无影响。
4 活血化瘀消癥杀胚中药对妊娠输卵管粘膜细胞超微结构(微绒毛、线粒体、细胞核、内质网)均有明显影响,提示活血化瘀消癥杀胚中药能够影响妊娠输卵管粘膜细胞的生理代谢过程的正常进行,从而影响着床在输卵管的胚胎组织的营养供给,促进胚胎组织凋死亡。
关键词   输卵管妊娠;中药治疗;作用机理;宫外孕I号方;Bcl-2;ER;PR;电镜;

引  言

  受精卵于子宫腔以外着床发育称异位妊娠,是妇科最常见的急腹症之一。[1]近年来,异位妊娠的发病率呈明显上升趋势。根据统计资料,异位妊娠发病率占所有怀孕总数的1%。[2]异位妊娠导致的孕产妇死亡率占产妇死亡率10%,是孕产妇死亡的重要原因。[3]异位妊娠中以输卵管妊娠最为常见,占异位妊娠的95%左右[4]。目前越来越多有生育要求的患者要求保留输卵管,因此,非手术治疗日益受到重视,中药治疗尤以其副作用小受到青睐。因此,研究活血化瘀消癥杀胚中药对于输卵管妊娠的作用机理研究十分必要。
  目前异位妊娠主要非手术治疗手段包括:期待疗法;西药治疗:甲氨喋呤、米非司酮、5-氟尿嘧啶等;中药治疗,主要原理是活血化瘀、消癥杀胚,主要成分有蜈蚣、紫草、花粉、归尾、川芎、赤芍、丹参、牡丹皮、水蛭、乳香、黄芪、甘草等。宫外孕I号、Ⅱ号方为治疗异位妊娠的经典方。中医认为,异位妊娠主要是血瘀少腹。其病机为少腹瘀滞, 气血失调,冲任不畅,胎孕经量异常,胞脉破损,阴血外溢。治宜活血化瘀,消瘀散结为主。宫外孕1号方活血化瘀,扩张血管,增加血流量,促进新陈代谢,软坚散结,促进瘀血及包块吸收,故疗效较佳。宫外孕I号方能够促进纤维蛋白原在肝脏合成,降低血浆纤维蛋白原溶解活性,对凝血和防止出血有一定意义。宫外孕Ⅱ号方可使血流量增加,血管舒张,对改善循环状况,促进散瘀有一定作用。[5]目前,我院根据多年临床研究总结出的一整套异位妊娠评分标准治疗方案,多途径用药。邓高丕[6]等根据病情影响因子对输卵管妊娠评分后再予中药治疗相对稳定的异位妊娠取得良好疗效,其中对于异位妊娠未破损期胎元阻络型有效率可达到88.89%。[7]
  胚泡着床是在一个极短的特定的时间(着床期)内发生的,雌激素受体(estrogen receptor,ER)和孕激素受体(progesterone receptor, PR)在子宫内膜发育和胚泡着床过程中期的重要作用已得到公认。Bcl-2是原位癌基因的一种,又是重要的凋亡节基因。检测输卵管妊娠输卵管黏膜ER、PR、bcl-2及电镜观察对判断异位妊娠的治疗效果有重要意义。
近年来,关于中药治疗异位妊娠的报道较多,但是,究竟其作用机制如何却鲜有报道。本课题拟采用活血化瘀消癥杀胚中药,中药治疗输卵管妊娠,收集用药后要求中转手术治疗的患者手术切除的输卵管,检测绒毛蜕膜组织结构、细胞凋亡调控因子Bcl-2和雌孕激素受体的表达等方面的影响,探讨其对输卵管妊娠的作用机制。

上篇   文献研究
 

  孕卵在子宫腔以外的部位种植、发育称为异位妊娠。近年来,随着人工流产、盆腔炎患者增多,发病率有上升趋势。据资料统计,近年来异位妊娠发病率占所有已知怀孕总数的1% [7] ,异位妊娠是妇科常见的急腹症,其中约95%为输卵管妊娠,另外2-3%在子宫角部,其余的可能发生在卵巢、宫颈或腹腔。[8] 目前由于患者自我保护意识的提高,以及B超的广泛应用、高敏感度血β-HCG测定和腹腔镜诊断推广应用,80%的异位妊娠可以在未破裂前得到诊断。异位妊娠的早期诊断给药物治疗创造了条件。而且目前越来越多有生育要求的患者要求保留输卵管,因此,药物治疗日益受到重视。目前主要药物的治疗手段包括:西药治疗:甲氨喋呤、米非司酮、5-氟尿嘧啶等;中药治疗,主要原理是活血化瘀、消癥杀胚,主要成分有蜈蚣、紫草、花粉、归尾、川芎、赤芍、丹参、牡丹皮、水蛭、乳香、黄芪、甘草等以调节机体免疫能力,改善局部血液循环,并阻止滋养细胞及胚胎生长,致胚胎死亡而逐渐被吸收。宫外孕Ⅰ号、Ⅱ号方为治疗异位妊娠的经典方。胚泡着床是在一个极短的特定的时间(着床期)内发生的,雌激素受体(estrogen receptor,ER)和孕激素受体(progesterone receptor, PR)在子宫内膜发育和胚泡着床过程中起的重要作用已得到公认。Bcl-2是原位癌基因的一种,又是重要的凋亡调节基因。检测输卵管妊娠输卵管黏膜ER、PR、妊娠组织bcl-2及输卵管粘膜细胞电镜观察对探索异位妊娠的中药治疗作用机理有重要意义。现综述如下:
1.1 雌、孕激素受体,Bcl-2,病理超微结构在输卵管妊娠中的研究现状:
1.1.1  ER、PR在输卵管妊娠中的研究现状:
  雌、孕激素受体在子宫内胚泡着床过程中所起的重要作用已得到公认。无论对动物或人研究均表明,ER、PR在正常输卵管均有表达[9,10,11],并且与孕卵的发育、 运输密切相关[10,11] 。研究表明,在月经周期中子宫内膜PR表达呈明显的周期性变化:增生早期(第7~8天)PR刚出现;增生晚期、分泌早期(9~19天)腺上皮PR表达显著增多;分泌中晚期(第20~27天) 腺上皮PR表达消失。月经周期中PR表达最显著的变化是分泌中晚期在腺上皮消失。[13]分泌中晚期对应着床窗口期,此期PR表达水平下降,有助于子宫内膜分化,促着床物质表达增强,如LIF、整合素αvβ3、VEGF等[12]。因此,分泌期内膜腺上皮PR表达下降是子宫内膜分化发育的前提,与子宫内膜容受性的形成密切相关。[13] ER、PR在子宫内胚泡着床过程所起的重要作用已得到公认, 但有关ER、PR在输卵管妊娠中所起的作用国内外报道其少。已有的研究证明,分泌中期是着床窗开放时期, 分泌中期PR在子宫内膜腺上皮的表达。下降与子宫内膜形态分化、功能改变密切相关,是内膜分化成熟的标志,也是子宫容受性建立的前提之一[14]研究观察到,ER、PR,尤其PR在止常分泌期输卵管中的阳性生表达率较高,与分泌期子宫内膜中ER和PR表达水平降低的变化恰好相反;而输卵管妊娠时其黏膜上皮的ER、PR,尤其PR的表达率显著下降,与着床窗期子宫内膜中ER、PR表达下降相一致,提示分泌期输卵管黏膜ER、PR表达水平的下调在输卵管妊娠中起着一定作用,在生理状态下,分泌期输卵管ER、PR的强阳性表达,犹如一层防护屏障,延迟输卵管黏膜的发育和成熟,使其与胚泡的发育不能同步,避免输卵管着床的发生;当某种(些) 因素使分泌期输卵管黏膜ER、PR表达下降时(病理状态),输卵管黏膜失去了防护屏障,腺细胞分泌活动增强,促进输卵管黏膜的分化,从而使着床物质表达增强,发生了类似于分泌期子宫内膜的变化,为胚泡着床准备了有利的条件,导致与宫内着床相似的输卵管着床的发生,但确切的机制还有待于进一步研究[15] 。裴丹,唐颖等[16]用免疫组化的方法观察了正常输卵管和异位妊娠输卵管中ER、PR的表达,结果显示在增生期和分泌期输卵管黏膜上皮中的表达均较强;在异位妊娠输卵管黏膜上皮中的表达明显下降,与国外同类文献报道相同[17][18]ER、PR在子宫内膜腺上皮中的表达呈周期性变化,表现为增生期表达较高,分泌期表达较低,尤其PR,在分泌中期,子宫内膜腺上皮PR表达迅速降低,甚至消失[19]。分泌中期是受精卵在子宫着床窗开放时期,分泌中期PR在子宫内膜腺上皮的表达下降与子宫内膜形态分化、功能改变密切相关,是子宫容受性建立的前提之一。输卵管与子宫皆起源于苗勒氏管, 二者着床机制应该有相同之处。研究发现,ER、PR,尤其是PR在正常分泌期输卵管中的表的较强,未成下降趋势,与分泌期子宫内膜中ER和PR表达水平变化恰好相反;而在异位妊娠输卵管中ER、PR的表达水平则显著降低,与分泌中期子宫内膜中ER和PR表达水平变化相似,提示ER、PR表达水平的下调在输卵管妊娠形成中起着重要的作用[16] 。研究表明,口服PR拮抗剂-米非司酮后,可见分泌期子宫内膜PR表达增强,内膜发育延迟,[20]同样也可使分泌期输卵管PR表达增强[21] ;提示在生理状态下,ER、PR在分泌期输卵管中的阳性表达,犹如一层防护屏障,保护输卵管,避免输卵管着床发生;当某种(些)因素使分泌期输卵管黏膜ER、PR表达下降(病理状态)时,输卵管黏膜失去了防护屏障,可能发生与宫内着床相似的输卵管着床。由此可见,输卵管ER、PR表达升高会减低输卵管粘膜对胚胎细胞的容受性。P是维持早期妊娠唯一必需的甾体激素。P使子宫内膜发生蜕膜化,刺激输卵管腺体和子宫内膜分泌营养物质,供养合子及胚囊;P可提高子宫内膜容受性,阻止T一淋巴细胞介导的母体免疫排斥作用;P还可抑制子宫的自发性收缩和宫颈成熟。 [23]
1.1.2 bcl-2在输卵管妊娠中的研究现状:
  bcl-2是原位癌基因的一种,是重要的凋亡调节基因,其主要作用目前认为是通过抑制线粒体促进凋亡因子的释放而抑制细胞凋亡[24]。Kokawa[25]等发现异位妊娠以合体滋养层中细胞凋亡占多数,在早孕阶段,孕卵的着床部位影响凋亡发生。凋亡调节中,bcl-2是凋亡抑制基因,起着保护细胞免于凋亡的作用,原癌基因Bcl-2是细胞凋亡的调控因子[26]。最早在滤泡状B细胞淋巴瘤中发现,将bcl-2基因转移到小鼠细胞中发现其产生的蛋白bcl-2的生理功能主要是阻遏细胞凋亡, 延长细胞寿命,故将其称为凋亡抑制基因。bcl-2的表达产物位于线粒体内膜、 核膜和内质网膜上。不同亚细胞定位的bcl-2在不同的细胞凋亡信号途径中发挥作用。线粒体膜上的bcl-2通过控制线粒体的膜电位、调节线粒体膜的通透性等途径来抑制凋亡。研究表明定位于内质网膜的bcl-2可能通过阻断 Ca2+从内质网向胞质中的流动而抑制凋亡。[27]免疫组化发现输卵管妊娠破裂型的bcl-2染色带及强度较高[28],提示Bcl-2可作为输卵管妊娠破裂的一种新的免疫组化标记。所以bcl-2等可以通过维护线粒体膜的稳定,阻止其释放死亡因子发挥抗凋亡作用[29]。刘凛[30]将破裂型输卵管妊娠与未破裂型相比较,发现破裂型的bcl-2血清水平明显高于未破裂型,可能由于破裂型输卵管妊娠抗凋亡因素占优势,较未破裂型存在更强的侵袭活性,与Kucera[28]等的研究结果相似:他们观察到bcl-2在破裂型输卵管妊娠组中阳性染色区和染色强度明显高于未破裂组,认为bcl-2可作为预后输卵管妊娠破裂的一个新的指标。从另一方面来看,如果治疗可以降低bcl-2水平,由于微环境不同,可能细胞凋亡的发生就不会被抑制,使细胞侵袭能力减弱,侵袭的严重程度下降,输卵管不会因为异位妊娠病灶过度增殖和侵袭而承受更大的张力,异位妊娠病灶绒毛滋养细胞凋亡而发生自然流产,发生异位妊娠病灶破裂的几率也就会降低。所以bcl-2可以作为鉴定药物治疗是否有效地指标之一。
1.1.3 输卵管妊娠的病理研究现状:
  国内以正常宫内妊娠子宫蜕膜组织及正常输卵管组织作为对照,对来自手术切除的输卵管妊娠组织进行了比较系统的比较研究。在显微镜下观察了输卵管妊娠时输卵管的组织病理学改变,采用免疫组织化学和图像分析技术检测ER和PR的表达水平,图像分析结果显示:与正常妊娠输卵管壶腹部比较,输卵管壶腹部妊娠时,黏膜皱壁变宽,可见二级分支,输卵管黏膜上皮细胞变低矮,固有层间质细胞变大,类似子宫蜕膜细胞,但比子宫蜕膜细小,排列不整齐。输卵管宫腔内可见典型的蜕膜细胞核绒毛膜组织。但滋养层细胞发育较差,两层滋养层细胞不明显,其中轴的结缔组织成分较少,且分布稀疏。输卵管妊娠ER和PR阳性表达的平均光密度及阳性面积百分率,均强于正常输卵管黏膜组织中的表达,但弱于正常早孕子宫蜕膜组织中的上皮(以子宫腺上皮为主)细胞核及蜕膜细胞核的阳性表达,差异均有显著性(P<0.05)。张品南等对1000例输卵管妊娠临床病例研究中通过显微镜检查:在该次研究中样本输卵管管腔内容物或凝血块中均见绒毛并伴滋养叶细胞或蜕膜样细胞。输卵管本身病变有:慢性非特异性炎600例(60% );结节性输卵管炎20例(2% );输卵管周围炎16例(1.6% ),且多伴有明显扭曲与粘连;管壁子宫内膜异位8例(0.8% );管壁脂肪组织浸润20例(2% ),且多侵及管壁纵肌层,多见于体型肥胖者。输卵管黏膜蜕膜反应差,其表面无尼氏层(Nitabuch layer),少数病例尚见合体滋养细胞浸润管壁肌层。电镜观察发现:置IUD者输卵管粘膜上皮脱失,细胞器结构不清,仅见线粒体高尔基体痕迹;分泌细胞病变较重,和结构不清,顶浆分泌后的断端残破不平,内质网扩张、断裂,线粒体空泡变性。
2.1 中医药物治疗研究现状:
2.1.1 活血化瘀消癥杀胚中药终止早期妊娠的机理研究:
  丹参:味苦、微辛、微寒,入心、肝经。本品为活血化瘀之要药,临床广泛用于各种血瘀证。《神农本草经》:“味苦,微寒。治心腹邪气,肠鸣幽幽如走水,寒热积聚,破癥除瘕,止烦满,益气。”《日华子本草》:“养神安志,通利关脉,治冷热劳,骨节疼痛,四肢不遂,排脓,止痛,生肌,长肉,破宿血,补新生血,安生胎,落死胎,止血崩,带下。调妇人经脉不匀,血邪心烦恶疮疥癣,瘿赘肿毒,丹毒,头痛,赤眼,热温狂闷。”
  赤芍:味苦,微寒。归肝经。功效清热凉血、散瘀止痛、清肝泻火。有解热、镇痛、镇静、解痉、抗惊厥的作用。《景岳全书》:“白者安胎热不宁,赤者能通经破血。” 《日华子本草》:“芍药治风、补劳,主女人一切病,并产前后诸疾,通月水,退热,除烦,益气,天行热疾,瘟瘴,惊狂,妇人血运,及肠风,泻血,痔瘘。发背,疮疥,头痛,明目,目赤努肉。赤色者多补气,白者治血。”
  桃仁:性苦,甘,平,入心、肝、大肠经。本品味 苦而人心肝血分,善泄血滞,祛瘀力较强,又称破血药。《景岳全书》:“味苦辛微甘,气平,阴中有阳,入手足厥阴经。去皮尖用。善治瘀血血闭,血结血燥,通血隔,破血癥,杀三虫,润大便,逐郁滞,止鬼疰血逆疼痛膨胀,疗跌扑损伤。若血枯经闭者,不可妄用。”
  天花粉:性咸、寒,能清热凉血,解毒散结。孙星火等[32]采用天花粉蛋白杀胚结合消瘢药物治疗异位妊娠50例,有效45例,无效5例,有效率达90.0%。有生育要求的17例输卵管通畅率达94.1%。所有病例随访无一例发生再次异位妊娠。施晓华[33]运用天花粉药物针剂保守治疗异位妊娠l34例,仅1例最终手术治疗,总有效率高达99.25%。天花粉的药理作用是选择性地直接损伤绒毛滋养层细胞使之广泛变性坏死纤维素沉着,导致绒毛血窦血流阻塞,引起胚胎死亡而终止妊娠。[31]现代药理学研究表明,天花粉有致流产和抗早孕作用。天花粉蛋白直接作用于胎盘滋养房细胞,可致细胞变性坏死,使绒毛膜促性腺激素和甾体激素减少,前列腺素合成增加,宫缩增强而导致流产。天花粉还可增强假孕兔的子宫自发活动,增加子宫肌条对15-甲基前列腺素F2a和催产素的反应。
  紫草:性寒,味甘、咸,归心、肝经。功效凉血活血、解毒透疹。李媛[34]用大剂量紫草配伍宫外孕Ⅱ号方治疗异位妊娠3O例.总有效率96%。
  蜈蚣:性辛、温、有毒,入肝经。具有解毒散结,通络止痛之功效。《本草从新》:“入厥阴肝经,善走能散,… …杀虫堕胎。” 《开宝本草》:“味辛,温,有毒。疗心腹寒热结聚,堕胎,去恶血。”
  近年来,在世界范围内的发病率有明显升高的趋势,针对近年来异位妊娠的中医中药药物性治疗方法加以概述。中医认为,异位妊娠主要是血瘀少腹。其病机为少腹瘀滞, 气血失调,冲任不畅,胎孕经量异常,胞脉破损,阴血外溢。治宜活血化瘀,消瘀散结为主。宫外孕1号方活血化瘀,扩张血管,增加血流量,促进新陈代谢,软坚散结,促进瘀血及包块吸收,故疗效较佳。宫外孕I号方能够促进纤维蛋白原在肝脏合成,降低血浆纤维蛋白原溶解活性,对凝血和防止出血有一定意义。宫外孕Ⅱ号方可使血流量增加,血管舒张,对改善循环状况,促进散瘀有一定作用。[5]
  中医疗法在治疗稳定型异位妊娠方面有独特的优势,输卵管妊娠的基础病机为少腹血瘀实证。故采用宫外孕I号方作为基础治疗方。方中丹参、赤芍活血化瘀止痛,桃仁活血化瘀理气,另外配合血府逐瘀口服液、大黄廑虫胶囊口服,双柏水蜜外敷,以加强活血化瘀之力。胎元阻络型是指在输卵管妊娠未破损期,胎元存活,阻滞冲任胞络。故此时以杀胚为主,同时行活血化瘀之法。加天花粉、紫草、蜈蚣杀胚,紫草、三七有活血止血之效,可预防输卵妊娠破裂出血。正虚血瘀型的病机特点为在输卵管妊娠破损期,气随血失,瘀血内阻。故在杀胚化瘀的同时需兼扶正,以防杀胚化瘀之力过于伤正而治疗效果不佳。故在杀胚药的基础上再加用党参、黄芪、鸡血藤等益气补血之品,以达到祛邪不伤正的治疗效果。[35]主要成分有蜈蚣、紫草、天花粉、归尾、川芎、赤芍、丹参、牡丹皮、水蛭、乳香、黄芪、甘草等以调节机体免疫能力,改善局部血液循环,并阻止滋养细胞及胚胎生长,致胚胎死亡而逐渐被吸收。宫外孕I号、II号方为治疗异位妊娠的经典方,有研究报道[6],宫外孕I号方能够促进纤维蛋白原在肝脏合成,降低血浆纤维蛋白原溶解活性,对凝血和防止出血有一定意义。宫外孕II号方可使血流量增加,血管舒张,对改善循环状况,促进散瘀有一定作用。其他对中药治疗异位妊娠的研究中,黄红玲[31]等对87例未破裂异位妊娠患者分别采用天花粉肌注、甲氨蝶呤(MTX)肌注和米非司酮口服三种方案治疗,治愈率分别为90.91%、76.92%和71.43%, 临床观察表明,天花粉在临床疗中医治疗仍是我国目前治疗输卵管妊娠手段之一。保守治疗免除了手术创伤,保留患侧输卵管,还可治疗并存的炎症及粘连,从而恢复输卵管功能,因而可以获得满意的远期生殖状态。
3.1 前期研究:
  随着输卵管妊娠诊断水平的不断提高,药物治疗已成为输卵管妊娠的主要治疗手段之一。笔者通过前期回顾性研究发现,输卵管妊娠未破损期(胎元阻络型),积分≤8分,13一HCG<1 000IU/L者;已破损期(正虚血瘀型),积分≤9分,13一HCG<1 000IU/L者,应用纯中药治疗可取得较好疗效,总有效率可达到85.7% 以上,并且通过与西药治疗比较,差异无显著性意义。而不满足此条件的病例中药治疗效果不佳,最高为55.4% ,且与西药治疗比较,差异有显著性意义。为进一步探讨中药治疗输卵管妊娠的临床效果,笔者采用前瞻性研究方法,根据前期研究判定的辨病辨证与病情影响因子的评分系统,通过综合评定输卵管妊娠病人的情况后,对符合条件的病人进行辨证中药治疗,结果表明输卵管妊娠的总有效率可达到89.66%以上,并与西药疗效无明显差别,与前期回顾性研究结论相符。[35]
  教科书 [36]把输卵管妊娠分为未破损期和己破损期,后者分休克型、不稳定型及包块型,这虽然指出了输卵管妊娠不同阶段的临床特征,但不能反映出该病在不同阶段的中医病机特点。如:用“胎元阻络”能较好地反映出在未破损早期胎元存活、阻滞胞脉胞络的病机特点。用“气血亏脱”代替“休克”更能反映出输卵管妊娠破损急性大出血时气随血失、气血亏脱的病机特点。用“正虚血瘀”取代“不稳定”更能紧扣该病发生破损不久时气血两虚、瘀血内阻的病机特点。包块的形成既可以发生在破损后,由血溢于脉外、瘀血积久成瘾而成,此为正虚血瘀型向病情稳定的方向转归;研究也发现,其包块也可以在未破损晚期,由于胎元死亡.但未能完全吸收,日久成癥而形成,此为胎元阻络型向愈的发展。观察中发现未破损晚期的瘀结成癥型的药物治疗效果比胎元阻络型为好,也可说明这个观点。因此,用“瘀结成癥”代替“包块型”更能反映输卵管妊娠胚胎死亡、瘀结日久成癥的状态。由此可见,该研究的辨证分型能更好地反映出输卵管妊娠在不同病情阶段的病机特点,更有利于中医理法方药的统一。
未破损早期胎元阻络型:当积分≤8分时,药物治疗的疗效较好,若尿HCG≤625 IU/L,此时胎元的活性不强,可选择中药治疗;若尿HCG≥l250 IU/L或包块直径>5 cm,则要加用西药杀胚,采用中西药结合治疗。当积分为9~l0分时,仍可选择中西药结合治疗,但应慎重。当积分≥l1分时,不宜药物治疗。
  瘀结成癥型:未破损晚期的瘀结成癥型,积分均≤1O分,用中药治疗的疗效佳。己破损期的瘀结成癥型,积分9~l0分时,可考虑用中药治疗,但疗效一般,应慎重。积分≥11分时,药物疗效一般不佳。大部分瘀结成癥型的HCG值均较低,故不需用西药杀胚。瘀结成癥型的药物治疗效果与是否应用西药杀胚无关,而与是否发生破损有关。该研究发现瘀结成癥型的停经史多>8周,HCG值较低,此时胚胎多已死亡。若在发病过程中无明显腹痛等破损表现时,属于未破损晚期,是胎元阻络型朝愈的方向转归,因此,其药物治疗的疗效较胎元阻络型好。若在发病过程中曾出现过突发下腹剧痛,然后疼痛逐渐缓解者,属已破损期,是正虚血瘀型向稳定方向发展,但由于曾有反复的内出血,盆腔易形成粘连包裹,因此药物治疗的疗效较未破损者差。
  正虚血瘀型:积分≤8分时,可药物治疗。积分=9分时,药物治疗的疗效一般,应慎重。当积分≥l0分时,不宜药物治疗。该研究发现,凡正虚血瘀型及已破损期瘀结成癥型经药物治疗失败而转手术者,术中均见内出血陈旧,盆腔广泛粘连,包块直径多>5cm,病变的输卵管肿胀、迂曲明显,甚则溃烂不成形。提示凡是已破损期者,当积分≥l0时,即使病情稳定亦宜及早手术,减少盆腔粘连的发生,有利于今后生育。
  气血亏脱型:该研究的病例中,气血亏脱型均较危重,全部采用手术治疗。此型中有些因较早发生破损,表现出停经时间短,包块直径小,故积分可低至l0分,但不能据此说明病情较轻。因此,气血亏脱型不论积分多少均应及时手术治疗。输卵管妊娠分为未破损期和已破损期。中医辨证为胎元阻络、瘀结成癥、正虚血瘀和气血亏脱型。未破损期瘀结成癥型,无论积分多少,均可用中药治疗。当胎元阻络型积分≤l0分、已破损期瘀结成癥型积分≤l0分、正虚血瘀型积分≤9分时,可用药物治疗,但当其积分达到可药物治疗积分的上限时,药物治疗的疗效一般,故选择应慎重。当胎元阻络型积分≥11分、已破损期瘀结成癥型积分≥11分、正虚血瘀型积分≥10分,以及气血亏脱型都应及时手术治疗。[37]
4.1 小结:
  ER、PR、Bcl-2在输卵管黏膜上的表达异常在输卵管妊娠发生中起了重要作用,在输卵管妊娠时,由于输卵管ER、PR的表达较弱,因此用米非司酮治疗输卵管妊娠的效果并不十分有效。反之而言,ER、PR、bcl-2的改变会影响到输卵管妊娠病灶的微环境,适当的变化可以降低输卵管破裂的几率,增加输卵管妊娠灶的死亡脱落流产的几率,可以作为药物治疗效果监测指标。活血化瘀消癥杀胚中药对输卵管妊娠部位绒毛蜕膜细胞微细结构,雌、孕激素受体水平Bcl-2水平可能造成影响,使异位妊娠病灶易死亡脱落,但是尚未有此方面报道。

中篇   实验研究

2.1 研究目的
  探讨活血化瘀消癥杀胚中药对于治疗输卵管妊娠的作用机理。
2.2 研究内容
  经过阅读文献,临床应用治疗异位妊娠的的活血化瘀、消癥杀胚中药可能对输卵管妊娠的绒毛蜕膜组织结构及超微结构和输卵管妊娠的输卵管粘膜组织ER、PR表达、绒毛Bcl-2的表达有影响。故我们采用前瞻性和回顾性的对照研究方法,观察活血化瘀、消癥杀胚中药宫外孕I号方加味对输卵管妊娠治疗的作用机制,收集中药治疗后的手术切除的输卵管同直接手术切除的输卵管,采用免疫组化的方法,检测输卵管妊娠部位输卵管粘膜的ER、PR表达及绒毛的Bcl-2表达,通过电子显微镜观察输卵管粘膜上皮细胞的超微结构变化。
2.3 研究对象
2.3.1 病例来源
  所有研究对象均来源于2008.9-2010.2在广州中医药大学第一附属医院妇科病房住院并经手术诊断为输卵管妊娠的病人。所有研究对象必须严格按照下列的诊断标准、纳入标准和排除标准进行筛选,收集符合纳入标准的治疗组病人15例,对照组15例。
2.3.2 诊断标准:
2.3.2.1 辨病标准:按照《妇产科学》(第七版)及《中华妇产科学》确立诊断标准。
① 有停经史(个别无明显停经史),下腹痛(小部分可无下腹痛),或有不规则阴道出血。
② 妇科检查:子宫常大或略大,一侧附件或可触及包块,有压痛。
③HCG阳性。
④盆腔B超:宫内未见孕囊,宫旁出现低回声区,或该区查有胚芽或原始心管搏动;或宫旁区无输卵管妊娠声像特征,但腹腔内存在无回声区或子宫直肠陷凹处有无回声区。
⑤可伴有腹腔移动性浊音或休克。
⑥诊断性刮宫及病检未见绒毛。
(①~④为必备诊断标准,⑤~⑥为参考诊断标准。)
2.3.2.2 中医分期辨证分型标准:
参考《中医妇科学》(规划教材 人民卫生出版社)和《女病诊疗全书》(邵丽黎 人民卫生出版社)将未破损期和已破损期分为以下证型:
①未破损期:
    胎元阻络型:符合未破损期的辨病分期标准,HCG阳性,或经B超证实为输卵管妊娠,但未破损。
    胎瘀阻滞型:胚胎已死,未发生输卵管破裂或流产,腹痛减轻或消失,可有小腹坠胀不适,切诊小腹有局限性包块,HCG阴性。
②已破损期:
    气血亏脱型:停经,或不规则阴道流血,突发下腹剧痛,面色苍白,冷汗淋漓,四肢厥冷,烦躁不安,甚或昏厥,血压明显下降,HCG阳性,后穹窿穿刺或B超提示有内出血。
    正虚血瘀型:输卵管妊娠破裂后不久,腹痛拒按,或有不规则阴道出血,可切及包块,头晕神疲。HCG阳性。
    瘀结成癥型:输卵管破损日久,盆腔血肿形成,腹痛减轻或消失,小腹坠胀不适,切诊小腹有局限性包块。HCG阴性。
2.3.2.3 确定病情影响因子和评分标准

2.3.2.4输卵管妊娠分组治疗方案

2.3.3 纳入标准
(1)符合诊断标准①~④,参考诊断标准⑤~⑥。
(2)符合中医分期、辩证分型标准中的未破损期的胎元阻络型。
(3)符合上述1、2点并评分为8分者。
2.3.4 排除标准
(1)不符合诊断标准和纳入标准者。
(2)心肝肾功能不全或有血液系统疾病者。
(3)输卵管妊娠合并宫内妊娠者。
(4)非输卵管性异位妊娠者。
(5)患者不合作,无法依方案进行者。
2.4研究方法:
2.4.1 治疗组:
  选取符合诊断标准、纳入标准、排除标准的病人,在病人知情同意的情况下(签署知情同意书见附表1)给予宫外孕I号方(丹参15g、赤芍15g、桃仁15g)加天花粉20g、紫草15g、蜈蚣6g,每日一剂,两次水煎服。由广州中医药大学第一附属医院药剂科统一制备。采集中药治疗服药3-7天患者要求改为手术治疗的病人的手术切除的妊娠输卵管。
2.4.2 对照组:
  选取符合诊断标准、纳入标准、排除标准的病人,在病人知情同意的情况下(签署知情同意书见附表2)直接要求手术治疗患者的手术切除的妊娠输卵管。
2.4.3 检测指标:
2.4.3.1 采用免疫组化的方法检测输卵管ER、PR的表达强度和输卵管妊娠绒毛组织Bcl-2的表达强度。
实验步骤:
①组织经过10%福尔马林固定,常规包埋,石蜡切片;
②切片经纯二甲苯脱蜡两次,每次6至8分钟;
③梯度酒精两分钟;
④自来水冲洗、PBS漂洗各3次,每次两分钟,
⑤加3%H2O2阻断内源性过氧化物酶,室温下作用10分钟;
⑥切片放入已沸腾的柠檬酸(PH6.0)修复液中,继续加热至溶液猫小气泡但不沸腾为度,保持10分钟;
⑦冷风,水浴冷却,室温放置约15分钟,PBS洗后擦干水分,划圈;加入正常羊血清封闭液,室温下作用10分钟;
⑧加入对应的第一抗体,湿盒内加入水200ml,微波炉一档加热2.5分钟,静置7分钟,换水重复一次;或37℃水浴箱/恒温箱1小时;
⑨PBS洗后加生物素化二抗,微波炉I档加热2.5分钟;
⑩PBS洗后加链霉菌卵白素-辣根过氧化物酶,微波炉I档加热2.5分钟,静止8分钟;
11PBS洗后加入DAB,显色1-5分钟;
12苏木素浅复染,常规脱水、封片、分析结果。
质量控制及注意事项:
①操作过程中组织必须保持在湿润状态,不能干燥;
②所加试剂以完全覆盖组织为度。

实验结果及评价方法:
结果判定采用双盲法,每张切片观察5个随机高倍镜视野,bcl-2表达按染色体强度判定,不着色为阴性(—),染色信号呈细颗粒状,浅棕黄色为弱阳性(+),染色信号呈粗颗粒状或块状,深棕黄色或棕黑色为强阳性(+++),介于弱阳性强阳性之间为中度阳性(++)。(—)记0分,(+)记1分,(++)记2分,(+++)记3分,求每例五个高倍视野评分的平均值,以SPSS10.0统计软件进行统计。

2.4.3.2 透射电镜检测:
(日立H-600透射电镜)
透射电镜样品制备操作步骤:
(1)对取材的要求:标本新鲜,大小为1~2mm3,取材的刀片要锋利,低温操作,通常为4℃,1min 内入固定液。
(2)前固定:3%戊二醛,4℃2~4h。
(3)0.1mol/L PBS漂洗,10min×2.
(4)后固定:1%锇酸1.5~2h,0.1mol/L PBS漂洗,5min×2。
(5)脱水:50%、70%乙醇逐级脱水,每级10min,80%、90%、100%丙酮逐级脱水,每级10min×2。
(6)置换;100%丙酮:环氧树脂Epon812包埋剂以1:1混合,置换40min。
(7)浸透:环氧树脂Epon812包埋剂37℃浸透过夜。
(8)包埋:将组织置包埋模内Epon812包埋剂包埋,60℃聚合48h。
(9)在解剖显微镜下修块,将组织块表面修平整,暴露组织并根据组织表面的形状修成梯形、正方形或长方形。
(10)切半薄切片:在美国AO超薄切片机下切1?m的半薄切片,并置水上展平。
(11)HE染色。
(12)在解剖显微镜下和普通显微镜下定位,通常定位后切面为0.09mm2。
(13)超薄切片:在AO超薄切片机下切40~60nm的超薄切片,用铜网捞片。
(14)电子染色:70%乙醇配制的饱和醋酸铀染色3min,双蒸水漂洗,铅染液染3min,双蒸水漂洗。
(15)干燥后电镜观察,并摄片。
2.5 统计方法:
采用SPSS10.0统计软件,根据方差齐性,计量资料采用秩和检验比较两组之间差异是否具有显著性。
2.6 一般资料比较
2.6.1 免疫组化检测对照组、观察组之间的一般资料比较:
根据诊断标准、纳入标准及排除标准,共收集30例患者作为研究对象进行免疫组化检测输卵管粘膜ER、PR表达水平,绒毛组织Bcl-2表达水平,其中直接手术切除一侧输卵管的患者15例(简称对照组),应用活血化瘀消癥杀胚中药治疗后要求手术切除一侧输卵管的患者15例(简称观察组),由于为小样本资料,采用秩和检验,两组的一般资料见表3-表5:
 
表3 免疫组化观察组、对照组两个独立样本年龄等一般情况的Mann-Whitney U 检验的秩次

2.6.2 通过免疫组化对照组、观察组之间的一般资料比较:
  两个独立样本的Mann-Whitney U 检验(表3、表4)和两个独立样本的K-S检验(表5)两组在年龄、孕周、孕次上无显著性差异(P值均>0.05),两组病例各占50%。两组具有可比性。
2.6.2电镜检测对照组、观察组根据诊断标准、纳入标准及排除标准,共收集20例患者作为研究对象进行电镜观察,其中直接手术切除一侧输卵管的患者10例(简称对照组),应用活血化瘀消癥杀胚中药治疗后要求手术切除一侧输卵管的患者10例(简称观察组),由于为小样本资料,采用秩和检验,两组的一般资料见表6-表8:

  通过电镜对照组、观察组两个独立样本的Mann-Whitney U 检验和K-S检验两组在年龄、孕周、孕次上无显著性差异(P值均>0.05),两组病例各占50%。两组具有可比性。
2.6.3 观察组使用中药治疗天数统计:
①免疫组化观察组中药治疗天数统计,见表9,表10,图1,图2,:

2.7 免疫组化实验结果统计分析
2.7.1 对照组、观察组输卵管妊娠绒毛Bcl-2表达强度数据统计分析:
2.7.1.1 对照组、观察组输卵管粘膜绒毛Bcl-2表达强度数据分布正态性检验
见表13、图5、图6:

  对照组数据分布正态性检验Shapiro-Wilk 检验,P=0.038<0.05,Kolmogorov-Smirnov检验,P=0.038<0.05,故该组数据不符合正态分布,观察组数据符合正态分布,遂进行秩和检验。
2.7.1.2 对照组、观察组输卵管粘膜绒毛Bcl-2表达强度数据秩和检验
见表14、表15、表16、图7:

  根据以上结果示:Mann-Whitney Test (两独立样本的Mann-Whitney U检验)P=0.003<0.05,所以在α=0.05的水平上拒绝H0,两组Bcl-2表达强度差异具有显著性。Two-Sample Kolmogorov-Smirnov Test(两个独立样本的K-S检验) P=0.009<0.05,所以在α=0.05的水平上拒绝H0,两组Bcl-2表达强度差异具有显著性。

  从对照组、观察组统计数据和箱式图可看出,观察组Bcl-2表达明显降低。
2.7.2 对照组、观察组输卵管粘膜粘膜ER表达强度数据统计分析:
2.7.2.1 对照组、观察组输卵管粘膜ER表达强度数据分布正态性检验
见表17、图8、图9。

  对两组数据分布分布正态性检验Kolmogorov-Smirnov检验,对照组P=0.002<0.05,故该组数据不符合正态分布,观察组P=0.200>0.05故该组数据符合正态分布,Shapiro-Wilk检验,对照组P=0.010<0.05,故该组数据不符合正态分布,观察组P=0.908>0.05,故该组数据符合正态分布,遂进行非参数秩和检验。
2.7.2.2 对照组、观察组输卵管粘膜ER表达强度差异性检验

  根据以上结果示:根据表14、表15示:对照组、观察组进行两独立样本的Mann-Whitney U检验 P=0.683>0.05,所以在α=0.05的水平上不能拒绝H0,两组ER表达强度差异不具有显著性。根据表13示:对照组、观察组两个独立样本的K-S检验 P=0.925>0.05,所以在α=0.05的水平上不能拒绝H0,两组ER表达强度差异不具有显著性。

  对照组、观察组间ER表达强度无明显差异。
2.7.3 对照组、观察组输卵管粘膜PR表达强度进行统计分析:
2.7.3.1对照组、观察组输卵管粘膜PR表达强度数据分布正态性检验
如表21、图11、图12:
表21 对照组、观察组输卵管粘膜PR表达强度数据分布正态性检验

  对照组PR表达强度数据分布分布正态性检验Kolmogorov-Smirnov检验P=0.200>0.05,Shapiro-Wilk 检验P=0.804>0.05,故该组数据符合正态分布,观察组数据分布正态性检验Kolmogorov-Smirnov检验P=1.020<0.05,Shapiro-Wilk 检验P=0.003<0.05,故该组数据不符合正态分布,遂进行非参数秩和检验。

2.7.3.2 对照组、观察组PR表达强度秩和检验
见表22、表23、表24、图13:

  根据以上结果示:Mann-Whitney Test (两独立样本的Mann-Whitney U检验)P=0.013<0.05,所以在α=0.05的水平上拒绝H0,两组PR表达强度差异具有显著性。Two-Sample Kolmogorov-Smirnov Test(两独立样本的K-S检验)P=0.028<0.05,所以在α=0.05的水平上拒绝H0,两组PR表达强度差异具有显著性。

  观察组输卵管粘膜PR表达水平明显高于对照组。

2.8 对照组、观察组输卵管粘膜电镜观察
2.8.1 观察评分:
  选取观察组10例,对照组10例,对其异位妊娠输卵管粘膜进行投射电镜观察,发现观察组输卵管粘膜微绒毛稀少,内质网扩张,线粒体致密,线粒体内结构消失,核固缩等改变。对照组输卵管粘膜纤毛微绒毛形态正常,形态清晰,内质网形态未见明显异常,线粒体结构清晰,核膜核仁清晰,未见异染色质。
  根据对照组和观察组纤毛微绒毛、线粒体、细胞核、内质网及是否出现胞质内空泡自拟评分表(见表25)为各个病例计分(文献搜索未查到相关评分表格,遂自拟表格进行评分),并行统计。

2.8.2 对照组、观察组电镜检测评分总和统计学分析。
2.8.2.1 对照组、观察组电镜检测评分总和分布正态性检验
见表26,图14,图15:

  观察组数据分布正态性检验P>0.05,符合正态分布,但对照组数据分布正态性检验P<0.05,不符合正态分布,选用秩和检验进行统计分析。
2.8.2.2 对照组、观察组电镜检测总分秩和检验,见表27、表28、表29、图16:

  根据Mann-Whitney检验对照组、观察组电镜检测总分比较 P=0.000<0.05,差异具有显著性;根据K-S检验对照组、观察组电镜检测总分比较 P=0.001<0.05,差异具有显著性。

  根据观察组、对照组电镜评分总分箱式图,观察组评分明显高于对照组。
2.8.3 对照组、观察组电镜检测评分分类统计学分析。
由于两组均为小样本,运用秩和检验进行统计分析。见表30、表31:

  经Mann-Whitney U 检验(双侧),观察组与对照组的妊娠输卵管黏膜细胞透射电镜超微结构有明显的差异。发现观察组的输卵管粘膜微绒毛稀少,内质网扩张,线粒体致密,线粒体内结构消失,核固缩。自拟评分表对其进行评分,并进行统计分析,两组评分差异具有显著性,经Mann-Whitney U 检验(双侧),对照组、观察组输卵管粘膜上皮细胞电镜超微结构纤毛微绒毛组间差异P=0.000<0.05,差异有统计学意义;线粒体改变组间差异P=0.001<0.05,差异有统计学意义;细胞核改变组间差异P=0.045<0.05,差异有统计学意义;内质网组间差异P=0.007<0.05,差异有统计学意义;胞内空泡组间差异P=0.143>0.05,没有统计学意义。

  根据对照组、观察组输卵管粘膜上皮细胞评分箱式图,观察组输卵管粘膜上皮细胞电镜超微结构纤毛微绒毛评分明显升高,故观察组输卵管粘膜上皮纤毛微绒毛较对照组稀少;观察组线粒体评分明显升高,故观察组输卵管粘膜上皮细胞内线粒体较对照组损伤严重;观察组细胞核评分明显升高,故观察组输卵管粘膜上皮细胞内细胞核较对照组损伤严重;观察组内质网评分明显升高,故观察组输卵管粘膜上皮细胞内线粒体较对照组损伤严重。

下篇   结  语

3.1 免疫组化检测研究结果讨论:
 3.1.1 根据表1、表2、表3、表4、表5、表6:通过两个独立样本的Mann-Whitney U 检验和两个独立样本的K-S检验两组在年龄、孕周、孕次上比较无显著性差异(P>0.05),表明两组一般资料均衡,具有可比性。            
3.1.2 根据表13、图5、图6:对照组和观察组输卵管妊娠组织Bcl-2表达强度数据不符合正态分布,宜采用秩和检验。
3.1.3 根据表14、表15、表16、图7:两独立样本的Mann-Whitney U检验,P=0.003<0.05,所以在α=0.05的水平两组Bcl-2表达强度差异具有显著性。Two-Sample Kolmogorov-Smirnov Test(两个独立样本的K-S检验) P=0.009<0.05,所以在α=0.05的水平上拒绝H0,两组Bcl-2表达强度差异具有显著性。观察组输卵管妊娠组织Bcl-2表达轻度较对照组明显减低。Bcl-2通过抑制线粒体促进凋亡因子的释放而抑制细胞凋亡[28],故将其称为凋亡抑制基因。免疫组化发现输卵管妊娠破裂型的bcl-2染色带及强度较高[13],提示Bcl-2可作为输卵管妊娠破裂的一种新的免疫组化标记。可能由于破裂型输卵管妊娠抗凋亡因素占优势,较未破裂型存在更强的侵袭活性。  从另一方面来看,治疗使胚胎妊娠组织细胞bcl-2表达水平减低,由于微环境不同,可能细胞凋亡的发生就不会被抑制,使胚胎绒毛细胞侵袭能力减弱,侵袭的严重程度下降,输卵管不会因为输卵管妊娠病灶增殖和向输卵管粘膜基层内浸润生长而承受更大的张力,输卵管妊娠病灶绒毛滋养细胞凋亡而发生自然流产,发生异位妊娠病灶破裂的几率也就会降低。所以输卵管妊娠组织细胞bcl-2表达水平下降可以证明活血化瘀消癥杀胚中药可能可以防止输卵管妊娠破裂的发生。
3.1.4 根据表17、图8、图9:对照组和观察组输卵管粘膜ER表达强度数据不符合正态分布,宜采用秩和检验。
3.1.5 根据表18、表19、表20、图10:两独立样本的Mann-Whitney U检验,P=0.683>0.05,所以在α=0.05的水平上两组ER表达强度差异不具有显著性。两个独立样本的K-S检验,P=0.925>0.05,所以在α=0.05的水平上两组ER表达强度差异不具有显著性。根据箱式图显示观察组与对照组输卵管粘膜ER表达强度未见明显差异。
3.1.6 根据表21、表22、图11、图12:对照组和观察组输卵管粘膜PR表达强度数据不符合正态分布,进行非参数检验。
3.1.7 根据表22、表23、表24、图13:两独立样本的Mann-Whitney U检验,P=0.013<0.05,所以在α=0.05的水平上两组PR表达强度差异具有显著性。两独立样本的K-S检验,P=0.028<0.05,所以在α=0.05的水平上两组PR表达强度差异具有显著性。根据箱式图观察组输卵管粘膜PR表达水平明显高于对照组。 [15]雌、孕激素受体在子宫内胚泡着床过程中所起的重要作用已得到公认。无论对动物或人研究均表明,ER、PR在正常输卵管有表达[16,17,18],并且与孕卵的发育、运输密切相关[17,18] 研究表明,在月经周期中子宫内膜PR表达呈明显的周期性变化:增生早期(第7~8天)PR刚出现;增生晚期、分泌早期(9~19天)腺上皮PR表达显著增多;分泌中晚期(第20~27天) 腺上皮PR表达消失。月经周期中PR表达最显著的变化是分泌中晚期在腺上皮消失。[20]分泌中晚期对应着床窗口期,此期PR表达水平下降,有助于子宫内膜分化,促着床物质表达增强,如LIF、整合素αvβ3、VEGF等[19]。因此,分泌期内膜腺上皮PR表达下降是子宫内膜分化发育的前提,与子宫内膜容受性的形成密切相关。[20]已有的研究证明,分泌中期是着床窗开放时期,分泌中期PR在子宫内膜腺上皮的表达。下降与子宫内膜形态分化、功能改变密切相关,是内膜分化成熟的标志,也是子宫容受性建立的前提之一[21] 。研究观察到,ER、PR,尤其PR在止常分泌期输卵管中的阳性生表达率较高,与分泌期子宫内膜中ER和PR表达水平降低的变化恰好相反;而输卵管妊娠时其黏膜上皮的ER、PR,尤其PR的表达率显著下降,与着床窗期子宫内膜中ER、PR表达下降相一致,提示分泌期输卵管黏膜ER、PR表达水平的下调在输卵管妊娠中起着一定作用,在生理状态下,分泌期输卵管ER、PR的强阳性表达,犹如一层防护屏障,延迟输卵管黏膜的发育和成熟,使其与胚泡的发育不能同步,避免输卵管着床的发生;当某种(些) 因素使分泌期输卵管黏膜ER、PR表达下降时(病理状态),输卵管黏膜失去了防护屏障,腺细胞分泌活动增强,促进输卵管黏膜的分化,从而使着床物质表达增强,发生了类似于分泌期子宫内膜的变化,为胚泡着床准备了有利的条件,导致与宫内着床相似的输卵管着床的发生,但确切的机制还有待于进一步研究[22]。由此可见,输卵管ER、PR表达升高会减低输卵管粘膜对胚胎细胞的容受性。分泌中期是受精卵在子宫着床窗开放时期,分泌中期PR在子宫内膜腺上皮的表达下降与子宫内膜形态分化、功能改变密切相关,是子宫容受性建立的前提之一。研究发现,ER、PR,尤其是PR在正常分泌期输卵管中的表的较强,未成下降趋势,与分泌期子宫内膜中ER和PR表达水平变化恰好相反;而在异位妊娠输卵管中ER、PR的表达水平则显著降低,与分泌中期子宫内膜中ER和PR表达水平变化相似,输卵管粘膜PR表达水平的降低可能与降低输卵管粘膜对胚胎的容受性,导致输卵管妊娠绒毛不能正常从输卵管粘膜蜕膜组织中吸取营养,最终导致输卵管妊娠胚胎失去营养供给,凋亡流产有关。
3.2 电镜检测研究结果讨论
3.2.1 观察组输卵管粘膜微绒毛稀少,内质网扩张,线粒体致密,线粒体内结构消失,核固缩等改变。对照组输卵管粘膜纤毛微绒毛形态正常,形态清晰,内质网形态未见明显异常,线粒体结构清晰,核膜核仁清晰,未见异染色质。
  根据对照组和观察组纤毛、线粒体、细胞核、内质网及胞内是否出现胞内空泡按表20为各个病例计分,并行统计。两组数据不符合正态分布,根据Mann-Whitney检验对照组、观察组电镜检测总分比较 P=0.000<0.05,差异具有显著性;根据K-S检验对照组、观察组电镜检测总分比较 P=0.001<0.05,差异具有显著性。
3.2.2 经Mann-Whitney U 检验(双侧),对照组、观察组输卵管粘膜上皮细胞电镜超微结构纤毛微绒毛组间差异 P=0.000<0.05,故差异具有显著性(有统计学意义),线粒体改变组间差异 P=0.001<0.05,故差异具有显著性(有统计学意义),细胞核改变组间差异 P=0.045<0.05,故差异具有显著性(有统计学意义),内质网组间差异 P=0.007<0.05,故差异具有显著性(有统计学意义),胞内空泡组间差异 P=0.143>0.05,故差异不具有显著性(没有统计学意义)。
3.2.2.1 两组均可见输卵管纤毛微绒毛稀少的病例,考虑输卵管妊娠患者多见输卵管炎导致的输卵管纤毛微绒毛稀少。观察组输卵管纤毛微绒毛稀少病例较多,程度较重,考虑活血化瘀消癥杀胚中药作用于输卵管,导致输卵管粘膜上皮细胞活性减弱,减少对输卵管妊娠组织的营养支持,从而促进输卵管妊娠组织凋亡。
3.2.2.2 观察组输卵管粘膜细胞内线粒体较对照组发生电子致密的例数多,并有线粒体脊模糊,线粒体为细胞,线粒体是真核细胞的重要细胞器,是动物细胞生成ATP的主要地点。它们内部基本上是空的,但具有复杂的膜结构。线粒体基质的三羧酸循环酶系通过底物脱氢氧化生成NADH。NADH通过线粒体内膜呼吸链氧化,与此同时合成ATP。合成的ATP进入细胞质后参与细胞的各种需能过程。线粒体的遗传基因(DNA)跟人的细胞核的DNA有质的不同,线粒体独立自主地复制繁衍,跟它寄主的细胞的繁衍没有关系。根据观察组线粒体的变化,考虑活血化瘀消癥杀胚中药作用于输卵管粘膜,导致输卵管粘膜内线粒体功能减退,ATP合成减少,细胞功能减退障碍,甚至坏死,不能为输卵管妊娠组织生长提供营养支持,从而促进输卵管妊娠组织凋亡。
3.2.2.3 观察组的内质网扩张较对照组多,且有些粗面内质网内面核糖体脱落,内质网(ER,Endoplasmic Reticulum),细胞质内由膜组成的一系列片状的囊腔和管状的腔,彼此相通形成一个隔离于细胞基质的管道系统,为细胞中的重要细胞器。实际上是一个连续的膜囊和膜管网,可分为粗面内质网和滑面内质网两大部分(粗面内质网也称为糙面内质网或颗粒型内质网,滑面内质网也称为光面内质网或非颗粒型内质网)。内质网联系了细胞核和细胞质、细胞膜这几大细胞结构,使之成为通过膜连接的整体。内质网负责物质从细胞核到细胞质,细胞膜以及细胞外的转运过程。粗面内质网上附着有大量核糖体,合成膜蛋白和分泌蛋白。光面内质网上无核糖体,为细胞内外糖类和脂类的合成和转运场所。粗面内质网不仅是核糖体的支架,而且是在核糖体上合成的分泌蛋白的运输通道。此外,能够对核糖体合成的多肽链进行一定的改造,或用于自身的装配和生成。滑面内质网具有解毒、合成脂类和分解糖元的功能,还参与分泌性蛋白的运输过程。所以内质网扩张甚至核糖体脱落等形态改变,证实活血化瘀消癥杀胚中药对输卵管粘膜细胞输卵管造成严重影响,使其蛋白质合成转运修饰加工,肽链的折叠组装运输受到影响,类固醇、脂类的合成与运输,糖代谢及激素的灭活等功能障碍,从而影响细胞新陈代谢的正常进行,减少为着床在输卵管的胚胎组织提供养分,促进胚胎组织凋亡。
3.2.2.4 细胞的凋亡现象是1 972年Kerr等人首先发现的[38] 。半光天冬氨酸可直接破坏细胞结构,如裂解核纤层,核纤层(Lamina)是由核纤层蛋白通过聚合作用而连成头尾相接的多聚体,由此形成核膜的骨架结构,使染色质(chromatin)得以形成并进行正常的排列。在细胞发生凋亡时,核纤层蛋白作为底物被半光天冬氨酸在一个近中部的固定部位所裂解,从而使核纤层蛋白崩解,导致细胞染色质的固缩。细胞接在凋亡过程中伴随着一系列的特征:包括染色质凝集、趋边化,凋亡小体样结构的形成等 [39,40]。吴曼,赵允,翟中和等综合了透射电镜与扫描电镜的观察结果,更详细地描绘出了细胞核在凋亡过程中形成凋亡小体的全过程。在凋亡初期,在CS-100中经细胞色素C温育诱导约0.5~1h,核内染色质被切断。[39,40,41,42,]核内骨架结构被部分破坏,导致了染色质呈现为凝集状态。细胞处于间期状态时,染色质通过端粒结台在核纤层上 [41,42],染色质的断裂使得染色质团块向连接在核纤层上的染色质端粒运动,出现了趋边化的现象。在此同时,支撑核膜的结构—— 核纤层也部分受到破坏14,失去核骨架支撑部分的核膜向外突起形成小泡。随着反应时间的延长,核骨架结构被破坏得更加剧烈,使外突的小泡扩大,染色质也被进一步切割,形成更小的片段,并足以穿过细胞核与小泡之间的缺口。于是,切割后的DNA 也随着核内物质向小泡内发生转移。所以在lh左右可以观察到大量的内含DNA 仍与细胞核相联系的小泡。当核的整个结构已不足以维系成长后的凋亡小体时.凋亡小体就从核上脱离,最终被释放出来。根据电镜检测输卵管粘膜细胞核的改变符合凋亡的形态改变,从而减少着床在输卵管的胚胎组织提供养分供应,促进胚胎组织凋亡。
3.3 结论
  本研究通过对2008年9月至2010年2月于广州中医药大学第一附属医院妇科住院病人经手术诊断为输卵管妊娠者,按照诊断标准、纳入标准和排除标准进行筛选,收集观察组对照组病例手术切除妊娠输卵管标本,进行免疫组化检验,测输卵管粘膜ER、PR表达水平,绒毛组织Bcl-2表达水平,并行电镜检测输卵管粘膜细胞超微结构变化,初步得出如下结论:
3.3.1 活血化瘀消癥杀胚中药可降低输卵管妊娠绒毛组织Bcl-2表达水平,从而阻碍了Bcl-2的抗细胞凋亡的作用,促进了输卵管妊娠胚胎组织死亡。
3.3.2 活血化瘀消癥杀胚中药可升高妊娠输卵管粘膜PR表达水平,从而降低输卵管粘膜对于胚胎组织的容受性,导致胚胎死亡。
3.3.3 活血化瘀消癥杀胚中药对妊娠输卵管粘膜ER表达水平无影响。
3.3.4 活血化瘀消癥杀胚中药对妊娠输卵管粘膜细胞超微结构(微绒毛、线粒体、细胞核、内质网)均有明显影响,提示活血化瘀消癥杀胚中药能够影响妊娠输卵管粘膜细胞的生理代谢过程的正常进行,从而影响着床在输卵管的胚胎组织的营养供给,促进胚胎组织凋死亡。
3.4 本研究的不足之处
3.4.1由于要考虑患者意愿,能收集到的中药治疗后改为手术切除一侧输卵管的标本较少,只有15例,样本数偏少。
3.4.2 由于时间关系,未能进行流式细胞仪方面的精确定量研究,免疫组化方面只进行了半定量研究。
3.4.3 由于本研究观察的是活血化瘀消癥杀胚中药宫外孕I号方加减的作用机理,对于该方内各个单药未进行药物机理研究,所以对于各个药物各自的作用机制有待于进一步研究。

 

参考文献 略

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